第五章目的基因的获取.ppt

第五章目的基因的获取目的基因的获取第一节基因组DNA片段化由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。二、随机片断化1）4bp的内切酶2.机械切割法1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列一、目前常用的方法①保护dNTP的5’端P或3’端-OH（2）合成过程原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具体的合成和延伸过程如图。化学合成的DNA片断一般在200bp以内。T4DNA连接酶2.互补延伸连接法1.直接合成基因DNA合成仪第三节PCR扩增获得目的基因PCR可以把指定的基因片段数量放大第四节从基因文库、cDNA文库获取目的基因一、基因文库的构建组织或细胞染色体DNA（2）目前常用的载体断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（2）载体与基因组DNA大片段的连接BamHⅠ切割反应不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接目的基因5´
3´人工接头及其应用4.基因组文库的大小若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106
克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用λ噬菌体载体可
构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所
需要的重组体克隆数可以减少到9×105,而要用柯斯质粒将
40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,
均可满足建库要求。1.cDNAlibrary（1）不含内含子序列。
（2）可以在细菌中直接表达。
（3）包含了所有编码蛋白质的基因。
（4）比DNA文库小的多，容易构建。分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。反转录酶随机引物引导的cDNA合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis)：
根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。
用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。③cDNA第二链合成cDNA第一链去掉发卡结构b.置换合成法：优点：a）合成cDNA的效率高
b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化
c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNAc.引导合成法：d.引物-衔接头法在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.cDNA文库的大小基因组DNA文库1基因组DNA文库的优点2cDNA文库的主要优点3cDNA克隆的主要的缺点四、基因文库的筛选与鉴定1、表型筛选法（二）基因文库的鉴定