第五章目的基因的获取扩增与检测及相关技术之获取电泳-PCR讲课PPT课件.ppt

第五章目的基因的获取、扩增与检测及相关技术1、物理化学方法
2、鸟枪法
3、化学合成法
4、基因文库
5、逆转录合成
6、PCR技术
7、凝胶电泳
8、酵母双杂交系统
9、杂交技术
10、生物芯片
11、DNA测序第一节目的基因的获取及相关技术一、物理化学方法
双链DNA碱基配对原则：
G≡C（3个氢键）
A=T（2个氢键）
DNA中GC含量高，热稳定性高，熔解温度（Tm值）高。
对GC含量高的基因，可适当控制温度使富含A=T区解链，富G≡C区仍维持双链，在利用S1核酸酶，切去单链部分，得到富含G≡C区的待分离基因。

海胆rDNA（核糖体DNA）基因的分离纯化就利用此法，其G≡C含量达63%。

二、鸟枪法
三、化学合成法

磷酸二酯法
磷酸三酯法
亚磷酸三酯法
固相合成法四、凝胶电泳1、定义与分类
电泳：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。
凝胶电泳：用琼脂糖或聚丙烯酰胺等作为支持介质的（区带）电泳法称为凝胶电泳。

琼脂糖凝胶电泳：检测、分离核酸(DNA、RNA)；
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)：检测分离蛋白质与小分子核酸

基因工程中重点应用琼脂糖凝胶电泳。◎2、琼脂糖凝胶电泳原理
核酸带负电荷：
单链：A-p-T-p-C-p-G-p-T……
双链：

琼脂糖凝胶是多孔状结构:◎琼脂糖凝胶是多孔状结构原理

带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。◎电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快。◎电泳装置电泳结束后的染色：
可用溴化乙锭（EB）对核酸进行染色，EB可嵌入到DNA的碱基对间。
被染色后EB可在紫外光下（300nm）观察，发出荧光。肉眼可分辨出50～100ng核酸。
用仪器（如凝胶成像系统）可达10～20ng。
◎电泳后凝胶在紫外光下观察结果DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带
3、琼脂糖凝胶电泳的影响因素
（1）凝胶类型与浓度：
琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链。
●常熔点琼脂糖：在100℃左右时呈液态，当温度下降到45℃以下时，凝聚成束状的琼脂糖凝胶；
●低熔点琼脂糖（LMP）：熔点：62～65℃
熔解后，在37℃可保持液态数小时；
在25℃可保持液态约10min◎
回收DNA分子
在65℃下将LMP琼脂糖凝胶熔化；
加入过量的酚抽提DNA；
离心获得含DNA分子的上清液；
直接酶切◎

凝胶浓度影响分辨率，琼脂糖凝胶电泳可用于0.1～60kbDNA片段的检测分离。
不同浓度的凝胶有各自的适用范围。◎

不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA的范围3、琼脂糖凝胶电泳的影响因素
（2）电压：
电压高，DNA迁移快。
一般采用低电压高浓度凝胶来提高分辨率。
◎3、琼脂糖凝胶电泳的影响因素
（3）电泳缓冲液：
pH8.0左右，离子强度0.02～0.05

硼酸盐缓冲液（TBE）：缓冲能力大于TAE；
醋酸缓冲液（TAE）：对高分子量DNA，TAE分辨率高于TBE。◎电泳仪与电泳槽电泳仪与电泳槽4、琼脂糖凝胶电泳的应用

（1）分离获得目的基因；
（2）检测DNA；
（3）粗测DNA分子量大小。◎
用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算SampleWell
25ng1kbladder
0.8%Agarose根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小AgarosegelelectrophoresisAgarosegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（简介）
缓冲液：TBE
凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（10％）。
PolyAcrylamideGels（简介）脉冲电场凝胶电泳（PFGE）（简介）
1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。
在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45度角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45度角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。
（简介