靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113198020A(43)申请公布日2021.08.03(21)申请号202110477920.2C12N15/85(2006.01)(22)申请日2021.04.29C12N15/62(2006.01)C12N5/10(2006.01)(71)申请人深圳市第二人民医院(深圳市转化A61K31/704(2006.01)医学研究院)地址518000广东省深圳市福田区华富街道笋岗西路3002号(72)发明人段莉徐丽梅梁宇杰徐晓(74)专利代理机构北京挺立专利事务所(普通合伙)11265代理人吴彩凤(51)Int.Cl.A61K47/46(2006.01)A61K47/42(2017.01)A61K38/17(2006.01)A61P35/00(2006.01)权利要求书1页说明书6页(54)发明名称靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用(57)摘要本发明涉及靶向给药技术领域，具体为一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，包括构建pCMV‑lamp2b质粒；将人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP‑1插入到pCMV‑1amp2b质粒上；制备含外泌体的上清液和超速离心法制备外泌体。本发明公开一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的应用，在于外泌体特异性靶向骨肉瘤细胞，使其内部装载药物靶向释放，特异性杀灭癌细胞。有益效果为：本发明采用人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP‑1作为外泌体的靶向多肽，分子质量小，能够增加携带基因的容量，并且人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP‑1的潜在靶点为硫酸乙酰肝素糖蛋白，其可以与骨肉瘤细胞有效且特异性结合，靶向性好，转染骨肉瘤细胞的效率高，具有广阔的应用前景。CN113198020ACN113198020A权利要求书1/1页1.一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：包括以下制备步骤：步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白(lamp2b)片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV‑Tag上，构建pCMV‑lamp2b质粒；步骤三：将人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP‑1插入到pCMV‑lamp2b质粒上，得到OSP‑lamp2b重组质粒；步骤四：将OSP‑lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到0SP‑lamp2b细胞系。步骤五：将细胞培养用的血清通过离心机进行离心8‑10h后，收取上清液，得到无外泌体血清培养液；步骤六：将OSP‑lamp2b细胞系在正常含血清的培养基中培养12‑36h后，等待细胞融合度达到60％‑70％时，移去原有含血清的培养基，换成含无外泌体血清培养液的培养基，继续培养24‑48h，细胞融合度达到80％‑95％时，用0.2μm滤器过滤，得到含外泌体的上清液；步骤七：将含外泌体的上清液放入高速离心机中，设置相对离心力为104g，4度高速离心20‑50min后，经0.22μm膜过滤后，设置相对离心力为105g，4度高速离心60‑90min后，弃去上清液，加入30‑50mlPBS缓冲液，混匀，设置相对离心力为105g，4度高速离心60‑90min后，弃去上清液，用30‑50mlPBS缓冲液重悬获得外泌体；步骤八：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。2.根据权利要求1所述的一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤三中，所述人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP‑1的核酸序列为：GCCAGCGGCGCCCTGAGCCCCAGCCGCCTGGACACC。3.根据权利要求1所述的一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤五中，所述离心机采用超速离心机，其相对离心力设置为105g，离心时所用的离心管材料为透明聚丙烯，无外泌体血清培养液放置于4℃冰箱保存。4.根据权利要求1所述的一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤七中，所述PBS缓冲液由80mmol/L的Na2HPO4、1.36mol/L的NaCl、20mmol/L的KH2PO4和26mmol/L的KCl组成，使用前，将PBS缓冲液在37℃水浴至完全溶解后，稀释10倍使用。5.根据权利要求1所述的一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤八中，所述药物为阿霉素、顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺中任意一种。6.一种如权利要求1‑5所述的靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的应用，其特征在于：所述外泌体特异性靶向骨肉瘤细胞，通过释放内部装载药物，特异性杀灭癌细胞。2CN113198020A说明书1/6页靶向骨肉瘤细