靶向外泌体及制备方法、应用、药物和药物递送系统.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115975051A(43)申请公布日2023.04.18(21)申请号202211460180.2A61K49/00(2006.01)(22)申请日2022.11.17A61P35/00(2006.01)(71)申请人东南大学地址210096江苏省南京市玄武区新街口街道四牌楼2号(72)发明人陆远姜俊张瑞任新玲吴婷丁明黄静章锐锋(74)专利代理机构北京同辉知识产权代理事务所(普通合伙)11357专利代理师张恩慧(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12N15/85(2006.01)A61K47/42(2017.01)权利要求书1页说明书12页附图3页(54)发明名称靶向外泌体及制备方法、应用、药物和药物递送系统(57)摘要本发明公开了靶向外泌体及制备方法、应用、药物和药物递送系统，属于抗肿瘤领域，本发明采用经过筛选的连接肽连接scFv以及lamp2b，设计并构建核苷酸表达质粒，转染HEK293T真核细胞，表达融合蛋白scFv‑lamp2b，超速离心后获得培养上清液中的靶向外泌体scFv‑Exo，该外泌体既保留了抗体scFv与EGFR结合的特异性和亲和力，又通过lamp2b确保了融合蛋白在外泌体膜表面定位，电子显微镜及粒度仪测量scFv‑Exo理化性质良好，免疫荧光显微镜及动物活体成像证实scFv‑Exo实现了内化入EGFR阳性肿瘤细胞的可行性和准确性。CN115975051ACN115975051A权利要求书1/1页1.一种靶向外泌体，其特征在于，包括通过单链抗体与外泌体膜蛋白融合表达得到的融合蛋白，其中单链抗体位于外泌体表面；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。2.根据权利要求1所述的靶向外泌体，其特征在于，包括编码所述融合蛋白得到核苷酸，其能够在真核细胞中表达所述融合蛋白；所述核苷酸的序列如SEQ.ID.NO.2所示。3.一种制备表达如权利要求1或2所述的靶向外泌体的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将如SEQ.ID.NO.2所示的核苷酸克隆入pcDNA3.1(‑)表达载体，构建重组质粒；将重组质粒转染大肠杆菌，并在含卡那霉素的培养基中培养，挑取克隆、扩增、提质粒；通过质粒瞬时转染法转染HEK293T细胞系，将细胞培养液更换为含无外泌体血清的培养液并扩大培养，采用超速离心法提取传代培养的已转染HEK293T细胞分泌的外泌体。4.权利要求1或2所述的靶向外泌体或权利要求3所述的制备方法制备的靶向外泌体在制备抗肿瘤药物、抗肿瘤辅助药物或肿瘤诊断药物中的应用。5.权利要求1或2所述的靶向外泌体或权利要求3所述的制备方法制备的靶向外泌体在制备靶向EGFR的药用外泌体载体中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述载体通过携带siRNA或microRNA进入肿瘤细胞内部并释放所述靶向外泌体。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述载体以纳米颗粒的形式进入肿瘤细胞内部。8.根据权利要求7所述的靶向外泌体，其特征在于，所述纳米颗粒是脂质体。9.一种药物，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的靶向外泌体或权利要求3所述的制备方法制备的靶向外泌体。10.一种药物递送系统，其特征在于,包括作为递送载体的如权利要求1或2所述的靶向外泌体或权利要求3所述的制备方法制备的靶向外泌体。2CN115975051A说明书1/12页靶向外泌体及制备方法、应用、药物和药物递送系统技术领域[0001]本发明涉及抗肿瘤领域，具体涉及一种靶向外泌体及制备方法、应用、药物和药物递送系统。背景技术[0002]表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)家族是一类跨膜蛋白受体，具有酪氨酸激酶活性，通过调节下游信号转导，在肿瘤细胞的发生、发展和转移中发挥重要作用。EGFR在肿瘤中高表达以及其在肿瘤生长分化中起的重要作用，使其成为肿瘤诊断、抗肿瘤治疗的重要靶点。目前，研发抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物已成为治疗恶性肿瘤生长和转移的重要手段之一。然而，在EGFR抑制剂研发中，虽有吉非替尼、西妥昔单抗等已被应用于临床，但疗效并非理想，其它一些生物抑制剂仍处于基础研究和临床研究阶段。同时，以EGFR作为靶点，寻找抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物是研发抗肿瘤新药或类似化合物的重要途径之一。发明内容[0003]针对现有技术的不足，本发明提出了一种基于抗EGFR单链抗体(singlechainantibodyfragment，scFv)及外泌体lamp2b膜蛋白的靶向外泌体及制备方法、应用、药物和药物递送系统，达到对肿瘤细胞起到特异性的杀伤作用。[0004]本发明的目