靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114540422A(43)申请公布日2022.05.27(21)申请号202210245129.3A61K9/50(2006.01)(22)申请日2022.03.14A61K47/46(2006.01)A61K31/713(2006.01)(71)申请人上海交通大学A61P35/00(2006.01)地址200240上海市闵行区东川路800号(72)发明人崔大祥徐淑月刘彬(74)专利代理机构上海恒慧知识产权代理事务所(特殊普通合伙)31317专利代理师徐红银(51)Int.Cl.C12N15/867(2006.01)C12N15/12(2006.01)C12N5/10(2006.01)C12N5/0775(2010.01)C12N15/113(2010.01)C12N15/87(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表1页附图7页(54)发明名称靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备与应用(57)摘要本发明提供一种靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备与应用，通过慢病毒转染细胞而后得到特别性质的外泌体从而建立靶向性更强的运载体系，用于基因引起疾病的靶向治疗。所述外泌体的制备包括过表达质粒的构建、慢病毒包装、制备目的蛋白高表达间充质干细胞、外泌体提取和制备装载siRNA的外泌体的步骤。本发明构建了具有高靶向性的外泌体，从而实现RNA药物的高效递送。以肿瘤细胞为例，改造后外泌体表面趋向因子蛋白表达提高八倍，表现出高靶向性及良好的受损部位聚集效果，实现高效的药物释放，在体外和体内都表现出极好的药物靶向递送效果且具有优良的生物安全性，是一种安全性高，靶向性高，适用范围广的药物运载体系。CN114540422ACN114540422A权利要求书1/2页1.一种靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、过表达质粒的构建：将载体质粒与PCR扩增的目的蛋白的DNA片段进行重组反应，得到载体与目的蛋白的DNA片段的连接产物；再将连接产物加入感受态细胞中，热击处理后筛选得到过表达质粒；S2、慢病毒包装：将过表达质粒与LentiviralMix质粒、转染试剂进行共转染293T细胞，然后收集病毒液；S3、制备目的蛋白高表达间充质干细胞：将步骤S2收集的病毒液加入干细胞中，再加入聚凝胺培养，然后筛选获得稳定感染的细胞株；S4、外泌体提取：将步骤S3获得的细胞株培养后第一次离心，所得上清液再加入缓冲层后进行第二次离心，收集靠近缓冲层的溶液；再将收集的溶液加入缓冲层后进行第三次离心，收集缓冲层中的颗粒，即得外泌体；S5、制备装载siRNA的外泌体：将siRNA与步骤S4获得的外泌体混合后，进行电转，然后孵育，即得装载siRNA的外泌体。2.根据权利要求1所述的靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述载体质粒为含PGMLV‑CMV‑MCS‑EF1‑ZsGreen1‑T2A‑puro载体质粒；所述目的蛋白为CXCR4蛋白，PCR扩增所述目的蛋白的DNA片段所采用的引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述重组反应的反应体系以总体积为20μl计，包括以下含量的各组分：组分含量5×CEBuffer4μl载体质粒50～200ng目的蛋白的DNA片段20～200ngExnase2μlddH2O补足到20μl所述载体质粒在反应体系中的浓度为2.5‑10ng/μl，目的蛋白的DNA片段的浓度为1‑10ng/μl；所述反应条件为50℃水浴反应10‑30min。4.根据权利要求1‑3任一项所述的靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述热击处理的条件为：42℃水浴中热击90S；所述筛选的具体步骤为：将热击处理后的感受态细胞先加入不含抗生素的SOC培养基中振荡培养，再加入到含有载体上对应抗性组分的培养基中倒置培养，然后测试得到正确的过表达质粒；所述过表达质粒为含PGMLV‑CMV‑H_CXCR4‑PGK‑puro质粒。5.根据权利要求1所述的靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述慢病毒包装的具体步骤为：先将过表达质粒与Lentiviral2CN114540422A权利要求书2/2页Mix质粒、转染试剂混匀于无血清DMEM培养基后，常温孵育；然后将孵育后的混合物加到293T细胞中混匀，培养4‑6h，吸弃上清；再加入新的DMEM完全培养基继续培养，48h后收集的上清液离心或过滤后