一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927452A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211695138.9A01H6/54(2018.01)(22)申请日2022.12.28(71)申请人武汉艾迪晶生物科技有限公司地址430074湖北省武汉市东湖新技术开发区神墩四路666号A区5层(72)发明人王高华邹洪锋段芳谢先荣刘伟智(74)专利代理机构南京纵横知识产权代理有限公司32224专利代理师徐瑛(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N15/55(2006.01)A01H5/00(2018.01)权利要求书1页说明书6页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法(57)摘要本发明公开了一种利用基因编辑技术改良大豆炸荚的方法，涉及分子生物学技术和基因工程领域；根据栽培大豆果荚成熟后易开裂表型以及通过分析鉴定出大豆可能是qPDH1基因表达造成的成熟果荚干燥后易开裂，以此构建了基因qPDH1的CRISPR/Cas9基因编辑载体，以及通过大豆的遗传转化技术，成功得到qPDH1被编辑的大豆植株，并获得了T1代的编辑苗，通过对T1代的大豆果荚干燥处理，发现被编辑的材料大豆果荚易开裂性状消失，有效地解决了大豆果荚易开裂的表型，对大豆规模化机械生产具有重要的意义。CN115927452ACN115927452A权利要求书1/1页1.一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、针对qPDH1基因表现型为裂荚的大豆品种，设计CRISPR/Cas9系统靶点，为gcatgttgtggcctcttcactgg；S2、构建大豆qPDH1基因编辑载体；S3、利用遗传转化技术将所述大豆qPDH1基因编辑载体导入到大豆种子材料的基因组中，筛选获得qPDH1基因功能丧失的大豆品种。2.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，所述大豆的品种为中豆40。3.根据权利要求2所述的一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，步骤S2具体为，使用pEGCas9PM4‑B空载、引物qPDH1‑TF和引物qPDH1‑TR构建大豆qPDH1基因编辑载体，所述引物qPDH1‑TF和引物qPDH1‑TR的核苷酸序列为：qPDH1‑TF:attgcatgttgtggcctcttcac；qPDH1‑TR:aaactgaagaggccacaacatgc；组装的具体方式为：取引物1μLqPDH1‑TF、1μLqPDH1‑TR、8μL无菌水，放入EP管中混匀，在PCR扩增仪上，先在95℃变性，再在55℃退火后，得到qPDH1引物混合液；再取1μLqPDH1引物混合液，与30ngpEGCas9PM4‑B空载、1μL10×CutSmartBuffer、35UT4DNA连接酶、10UBsal限制性内切酶和无菌水组成10μL混合体系，37℃培养1h；连接完成的混合液转化进入DH5a大肠杆菌感受肽细胞中，经过菌检，测序确认，最终组成pEGCas9PM4‑B‑qPDH1载体。4.根据权利要求3所述的一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，所述pEGCas9PM4‑B空载的序列如SEQIDNO.2所示，所述pEGCas9PM4‑B‑qPDH1载体的序列如SEQIDNO.3所示。5.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，步骤S3中，所述大豆遗传转化技术包括大豆种子灭菌、农杆菌EHA105制备、大豆种子萌发、外植体准备、侵染和共培养、恢复培养、筛选和再生、生长培养。2CN115927452A说明书1/6页一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法技术领域[0001]本发明涉及分子生物学技术和基因工程领域，特别涉及一种利用基因编辑技术改良大豆炸荚的方法。背景技术[0002]果荚开裂是豆类和十字花科作物种子传播的关键性状，在果荚类农作物生产过程中可导致显着的产量损失。一般果荚干燥后，导致果荚壁开裂的主要原因有：果荚壁结合强度的降低；果荚壁产生的开裂力。在大豆规模化机械生产过程中，果荚开裂是不可忽视的性状，在干旱和半干旱地区抗大豆果荚开裂性状至关重要。[0003]果荚开裂的本质是由细胞分离现象造成的，细胞分离必然牵涉到细胞壁的软化和降解，而纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶通过调控纤维素、半纤维素和果胶的降解来影响细胞壁的组成，参与果荚的开裂。[0004]现有技术中，文献《Dehiscence‑relatedexpressionofanArabidopsisthalianageneencodingapolygalacturonaseintransgenicplantsofBrassica