一种广谱型的新城疫病毒全基因组扩增引物和扩增方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113736826A(43)申请公布日2021.12.03(21)申请号202111145643.1C12N7/00(2006.01)(22)申请日2021.09.28C12R1/93(2006.01)(71)申请人洛阳职业技术学院地址471000河南省洛阳市伊滨区科技大道6号申请人河南科技大学(72)发明人郁川何雷杨梓朱文文张贺伟程相朝(74)专利代理机构西安铭泽知识产权代理事务所(普通合伙)61223代理人崔瑞迎(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12N15/10(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表2页附图3页(54)发明名称一种广谱型的新城疫病毒全基因组扩增引物和扩增方法(57)摘要本发明属于NDV的疫苗开发和以重组NDV为基础的其他生物制品制剂技术领域，具体涉及一种广谱型的新城疫病毒全基因组扩增引物和扩增方法。本发明以新城疫病毒的总RNA为模板反转录合成cDNA，通过引物Part1up/Part1down和Part2up/Part2down对cDNA进行RT‑PCR扩增得到Part1和Part2基因片段，经连接、转化，挑取阳性克隆得到新城疫病毒全基因组序列。本发明通过独特基因分段扩增方案，大大缩短建立重组NDV反向遗传系统的时间，该方案可用于所有新城疫病毒基因型，所需时间仅为目前已有方案的四分之一，并且保证病毒基因组的准确性和反向遗传系统构建的效率，在新城疫病毒疫苗的研发等方面具有极大的应用前景。CN113736826ACN113736826A权利要求书1/2页1.一种广谱型的新城疫病毒全基因组扩增引物，其特征在于，包括以下引物：Part1up：5′‑ACCAAACAGAGAWTCBGTGAG‑3′；Part1down：5′‑AAGAATACCCTCCCTGTTGC‑3′；Part2Up：5′‑GCAACAGGGAGRGTATTCTTYTC‑3′；Part2Down：5′‑ACCAAACARAGATTTGGTGAATG‑3′；V1up：5′‑AGGGAGRGTATTCTTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCC‑3′；V1down：5′‑GASTCTCTGTTTGGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGCG‑3′；V2down：5′‑AAATCTYTGTTTGGTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCC‑3′。2.利用权利要求1所述的引物快速扩增新城疫病毒全基因组的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取新城疫病毒的总RNA，以所述总RNA为模板，反转录合成cDNA；S2、以cDNA为模板，在Part1up/Part1down和Part2up/Part2down的引导下用RT‑PCR扩增得到Part1和Part2基因片段；S3、将Part1和Part2基因片段连接、转化，挑取阳性克隆、提取得到新城疫病毒全基因组序列。3.根据权利要求2所述的快速扩增新城疫病毒全基因组的方法，其特征在于，S2中，反应体系为：超纯水26μL，GXLpolymerase1μL，5×PSGXLBuffer10μL，2.5mM的dNTP10μL，Part1or2up1μL，Part1or2down1μL，模板3μL。4.根据权利要求3所述的快速扩增新城疫病毒全基因组的方法，其特征在于，S2中，反应程序为：98℃，5min；98℃，10s，54℃，15s，68℃，8min，共30个循环；68℃，10min。5.根据权利要求4所述的快速扩增新城疫病毒全基因组的方法，其特征在于，S3具体包括如下步骤：(1)利用引物V1up和V1down对模板pBluescriptSK+载体进行扩增，得到Vector‑1载体；(2)将Part1基因片段与Vector‑1载体连接、转化，挑取阳性克隆得到Vector1‑part1质粒；(3)利用引物V1up和V1down对模板Vector1‑part1质粒进行扩增，得到Vector‑2载体；(4)将Part1基因片段与Vector‑2载体连接、转化，挑取阳性克隆并提取质粒，获得新城疫病毒全基因组序列。6.根据权利要求5所述的快速扩增新城疫病毒全基因组的方法，其特征在于，步骤(1)和(3)中，反应体系均为：超纯水30μL，PfuΜLtraΙΙ1μL，10×PfuΜLtraΙΙBuffer5μL，2.5mM的dNTP10μL，V1up1μL，V1down1μL，100ng/μL的模板3μL。7.根据权利要求6所述的快速扩增新城疫病毒全基因组的方法，其特征在于，步骤(1)和(3)中，反应程序均为：90℃，2min；92℃，20s，55℃，20s，68℃，3min，