一种蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物和扩增方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106939309A(43)申请公布日2017.07.11(21)申请号201710279247.5(22)申请日2017.04.25(71)申请人广东省生物资源应用研究所地址510260广东省广州市海珠区新港西路105号(72)发明人张祎韩日畴(74)专利代理机构广州科粤专利商标代理有限公司44001代理人刘明星(51)Int.Cl.C12N15/11(2006.01)C12N15/10(2006.01)C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)权利要求书1页说明书3页序列表3页(54)发明名称一种蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物和扩增方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物和扩增方法及其应用。本发明分别以六对引物作为扩增引物的上下游引物，以蜜蜂西奈湖病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测序，然后再拼接比对，得到蜜蜂西奈湖病毒基因组全长序列。本发明针对蜜蜂西奈湖病毒主要致病基因型，根据基因组所包含的三个开放阅读框设计了的分段扩增策略，并根据保守区域设计相应的扩增引物；其能有效的扩增出蜜蜂西奈湖病毒的全基因组序列。本发明可广泛应用于蜜蜂及蜂产品、检验检疫等具有蜜蜂西奈湖病毒检测需求及相应的科研领域。CN106939309ACN106939309A权利要求书1/1页1.一种蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物：引物对1：LSV-1F：5'-GGGAAGTTTATGCCTCCTAC-3'；LSV-1R：5'-GATGATCGAGAAGAGCTGG-3'；引物对2：Orf1-F-78：5'-ATGAAGGTTGTCTTCTTGGTTTCG-3'；Orf1-R-2615：5'-TTACGCACCTTCGTTTGGGAGGT-3'；引物对3：RdRp-F-1852：5'-ATGATATCAAGTCTTGTGACGC-3'；RdRp-R-3720：5'-TTACGCGTAAAGAACAGACCTAAACT-3'；引物对4：LSV-3630：5'-TTCCTCTTACCGCTATCTTAAG-3'；LSV-3903：5'-GCCTATTAATAGACGAAGGCTG-3'；引物对5：Cap-F-3738：5'-GTGAATCCACCAACTACGACTAC-3'；Cap-R-5300：5'-TTACTTAGCGTCAAAGAAGATGT-3'；引物对6：LSV-5154F：5'-ATCTCCATGTTGCCGGGTGTAGG-3'；LSV-5909R：5'-GCTGTCGCAACAACCAACAGCGTT-3'。2.一种蜜蜂西奈湖病毒基因组的扩增方法，其特征在于，分别以权利要求1所述的引物对LSV-1F/LSV-1R、Orf1-F-78/Orf1-R-2615、RdRp-F-1852/RdRp-R-3720、LSV-3630/LSV-3903、Cap-F-3738/Cap-R-5300和LSV-5154F/LSV-5909R作为扩增引物的上下游引物，以蜜蜂西奈湖病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测序，然后再拼接比对，得到蜜蜂西奈湖病毒基因组全长序列。3.根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于，所述的RT-PCR扩增，其反应体系为：含有2×one-stepRT-PCRmixture10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，RNA模板2μL，其余由双蒸水补足至20μL。4.根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于，所述的RT-PCR扩增，其反应条件为：以引物对LSV-1F/LSV-1R作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对Orf1-F-78/Orf1-R-2615作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对RdRp-F-1852/RdRp-R-3720作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对LSV-3630/LSV-3903作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物