蝙蝠源轮状病毒基因组及筛选引物、扩增引物和扩增方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109706271A(43)申请公布日2019.05.03(21)申请号201910186414.0C12N15/11(2006.01)(22)申请日2019.03.12(71)申请人中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心地址210000江苏省南京市玄武区中山东路293号(72)发明人胡丹何婷艾乐乐谭伟龙丁晨曦章文吕瑞辰杨露傅云龙朱长强(74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)11350代理人王清义(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/686(2018.01)权利要求书1页说明书4页序列表5页附图3页(54)发明名称蝙蝠源轮状病毒基因组及筛选引物、扩增引物和扩增方法(57)摘要本发明公开了一种蝙蝠源轮状病毒基因组扩增和扩增方法及其应用，并公开了用于快速筛查蝙蝠源轮状病毒的引物对。本发明分别以4对引物作为扩增引物的上下游引物，以蝙蝠样本提取的轮状病毒RNA模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测序，然后在拼接比对得到蝙蝠源轮状病毒基因组部分节段序列。本发明针对蝙蝠源轮状病毒基因组特征和参考已知其他轮状病毒基因组序列，根据其基因组所包括的开放阅读框设计了分段扩增策略，并根据保守区域设计相应的扩增引物，能有效的扩增蝙蝠源轮状病毒全基因组序列。本发明可以广泛应用于蝙蝠源轮状病毒检测需求及相应的科研领域。CN109706271ACN109706271A权利要求书1/1页1.蝙蝠源轮状病毒基因组VP3，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。2.蝙蝠源轮状病毒基因组VP6，其DNA序列如SEQIDNO.2所示。3.蝙蝠源轮状病毒基因组VP7，其DNA序列如SEQIDNO.3所示。4.一种用于快速筛查蝙蝠源轮状病毒的引物对1，其上游引物序列如SEQIDNO.4所示，下游引物序列如SEQIDNO.5所示。5.权利要求4所述的引物对在快速筛查蝙蝠源轮状病毒中的应用。6.一种蝙蝠源轮状病毒基因组扩增引物对，其特征在于：包括以下4对引物：引物对2:VP3F1:SEQIDNO.6；VP3R1603:SEQIDNO.7；引物对3:VP3F1500:SEQIDNO.8；VP3R2591:SEQIDNO.9；引物对4：VP7F1：SEQIDNO.10；VP7R1062：SEQIDNO.11；引物对5:VP6F160：SEQIDNO.12；VP6R1356：SEQIDNO.13。7.一种蝙蝠源轮状病毒基因组扩增方法，分别以权利要求6所述的引物对2-5作为扩增的上下游引物，以蝙蝠样本中提取的轮状病毒RNA模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增引物，然后对扩增产物进行核酸测序，然后再拼接比对，得到蝙蝠源轮状病毒基因组VP3、VP7编码区序列和VP6部分编码序列。8.根据权利要求7所述的蝙蝠源轮状病毒基因组扩增方法，其特征在于：所述的RT反转录反应体系为：含有5×RT缓冲液5μL，50μΜOligdT/RandomHexamer引物混合液2μL，10mMdNTPs1.5μL，M-MLVRtase/RNAInhibitor混合液1μL，RNA模板7.5μL,加RNase-freeH2O8μL补足至25μL，反应条件：42℃水浴1h，75℃灭活10min。9.根据权利要求8所述的蝙蝠源轮状病毒基因组扩增方法，其特征在于：所述的PCR反应体系为：5×PrimeSTARGXLBuffer5μl、2.5mM的dNTPMixture2μl、10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.5μl、cDNA模板1μl、PrimeSTARGXLDNAPolymerase0.5μl，其余由双蒸水补足至25μL，其反应条件为：以引物对2作为引物的反应条件为：98℃预变性10s；65℃15s、68℃30s，共35个循环；以引物对3、4、5作为引物的反应条件为：98℃预变性10s；65℃15s、68℃90s，共35个循环。10.权利要求6所述的引物对在扩增得到蝙蝠源轮状病毒基因组序列中的应用。2CN109706271A说明书1/4页蝙蝠源轮状病毒基因组及筛选引物、扩增引物和扩增方法技术领域[0001]本发明涉及一种蝙蝠源轮状病毒基因组及筛选引物、扩增引物和扩增方法，属于生物技术领域。背景技术[0002]蝙蝠群体数量庞大，是仅次于啮齿类的第二大类哺乳动物群(Pattersonetal.1994)。蝙蝠携带的病原体种类较多，包括病毒、细菌和寄生虫等。目前，在蝙蝠体内已检测到60多种人畜共患病病毒，其中包含对人类高度致病的埃博拉病毒、狂犬病毒、马尔堡病毒和SARS样冠状病毒等。[0003]轮状病毒属于呼肠病毒属轮状病毒科，是导致幼龄动物