一种多功能化石墨烯载网及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113960089A(43)申请公布日2022.01.21(21)申请号202010696941.9(22)申请日2020.07.20(71)申请人清华大学地址100084北京市海淀区100084信箱82分箱清华大学专利办公室(72)发明人王宏伟陈亚楠刘楠胡翠霞(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人王春霞(51)Int.Cl.G01N23/2202(2018.01)G01N23/2251(2018.01)权利要求书1页说明书9页附图5页(54)发明名称一种多功能化石墨烯载网及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种多功能化石墨烯载网(MFG载网)及其制备方法。MFG载网的制备方法包括如下步骤：刻蚀采用CVD生长的石墨烯薄膜覆盖的铜箔作为电镜载网，即得到石墨烯载网；将石墨烯载网进行氧等离子体处理；然后采用含有EDC和NHS的MES缓冲液处理石墨烯载网；再采用氨三乙酸和生物素活化石墨烯载网；最后与镍盐反应即得。本发明MFG载网能够特异性地将目标生物分子锚定在其表面上，从而避免了空气与水的界面问题，而且还能够控制颗粒取向分布，通过把相关的蛋白纯化标签构建到每个生物大分子的不同方向上，提供了丰富的欧拉角，并且让生物大分子的结构解析更加的可靠以及更加的高效，因此，MFG载网将促进在结构生物学分析中应用冷冻电镜的通用性和可重复性。CN113960089ACN113960089A权利要求书1/1页1.一种多功能化石墨烯载网的制备方法，包括如下步骤：1)刻蚀采用CVD生长的石墨烯薄膜覆盖的铜箔作为电镜载网，即得到石墨烯载网；所述电镜载网上设有孔阵列；2)将所述石墨烯载网进行氧等离子体处理；3)采用2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液处理所述石墨烯载网；所述2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中含有1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基-磺基琥珀酰亚胺；4)然后采用氨三乙酸和生物素活化步骤3)处理后的所述石墨烯载网；5)将步骤4)处理后的石墨烯载网与镍盐反应即得到所述多功能化石墨烯载网。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述电镜载网上孔的直径为30～50微米；步骤2)中，所述氧等离子体处理的时间为6～12s。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中，所述1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为5～10mM，所述N-羟基-磺基琥珀酰亚胺盐的浓度为5～10mM。4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述处理的时间为30～60min。5.根据权利要求1-4中任项所述的制备方法，其特征在于：步骤4)之前，所述方法还包括采用TBE缓冲液洗涤所述石墨烯载网的步骤。6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤4)中，采用含有所述氨三乙酸和所述生物素的TBE缓冲液活化所述石墨烯载网；所述TBE缓冲液中，所述氨三乙酸的浓度为10～15mM，所述生物素的浓度为30～40mM；所述生物素为O-(2-氨基乙基)-O′-[2-(生物素基氨基)乙基]八聚乙二醇、O-(2-氨基乙基)-O′-[2-(生物素基氨基)乙基]二聚聚乙二醇或O-(2-氨基乙基)-O′-[2-(生物素基氨基)乙基]十聚乙二醇；所述活化的时间为1～3h。7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤5)中，所述镍盐为硫酸镍、氯化镍或硝酸镍；向所述石墨烯载网滴加所述镍盐的水溶液；所述反应的时间为0.1～1.5小时；所述镍盐的水溶液的浓度为1.0～15mM。2CN113960089A说明书1/9页一种多功能化石墨烯载网及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种多功能化石墨烯载网及其制备方法，属于生物冷冻电镜技术领域。背景技术[0002]由于冷冻电镜技术相关硬件和软件的持续发展，冷冻电子显微镜(cryo-EM)现在已成为解决生物大分子原子分辨率结构的常规方法，这极大地扩展了在分子水平上对生物学机制的理解。然而，该方法仍然面临一些关键的技术挑战，特别是对于冷冻样品制备而言。在实践中，将少量含有生物分子的溶液滴加到由支撑膜(例如多孔碳膜)覆盖的新鲜辉光放电的载网上，然后在液态乙烷中骤冷。理想地，预期生物分子将被定向富集地嵌入由无噪音膜支撑的薄玻璃化冰层中，但实际上并不是这种情况，并且生物分子的嵌入方向不可控。在大多数情况下，生物分子颗粒被吸收到空气-水界面中，这会导致生物分子的变性和优势取向问题，从而使后续的三维重构无法实现或结果不可靠。[0003]面对这些问题，在冷冻样品制备中探索了无定形碳薄层作为支撑膜。然而，碳膜具有许多缺点，