一种融合基因原位检测方法、试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114075601A(43)申请公布日2022.02.22(21)申请号202010828459.6(22)申请日2020.08.18(71)申请人派德洛格（天津）生物科技有限公司地址300041天津市和平区小白楼街解放北路188号信达广场1105室(72)发明人赵丹王欢(74)专利代理机构天津市尚文知识产权代理有限公司12222代理人郭平平(51)Int.Cl.C12Q1/6886(2018.01)C12Q1/6841(2018.01)C12Q1/682(2018.01)权利要求书1页说明书7页序列表5页附图2页(54)发明名称一种融合基因原位检测方法、试剂盒及其应用(57)摘要本发明提供了一种融合基因原位检测方法及其试剂盒，所述方法包括：通透细胞；基因组DNA的平末端处理，暴露平末端；暴露融合基因DNA；探针锁定；信号放大；信号检测。本发明还提供了所述融合基因原位检测方法及其试剂盒在癌细胞重排融合基因检测中的应用。本发明的有益的技术效果在于所提供的方法无需核酸提取，细胞用量少；特异性的探针放大目标信号，灵敏度高；对细胞核进行原位检测，鉴定基因位置变化从而确定是否发生基因融合。本发明提供的方法可以用于所有实体肿瘤中人ETV6‑NTRK3融合基因的检测，具有广泛适用性的优点。CN114075601ACN114075601A权利要求书1/1页1.一种融合基因原位检测方法，所述融合基因至少包括第一基因和第二基因，其特征在于，所述方法包括：步骤一：通透细胞；步骤二：基因组DNA的平末端处理，暴露平末端；步骤三：暴露融合基因DNA；步骤四：探针锁定；步骤五：信号放大；步骤六：信号检测。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤二中，spacerguideRNA和Cas蛋白识别第一基因和/或第二基因位点，将第一或第二基因位点处的基因组DNA平末端化，暴露平末端。3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤三通过核酸外切酶从平末端开始降解双链DNA5`-3`方向的单链DNA，保留另一条基因组单链DNA。4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤四中，基因检测探针与融合基因结合，包括第一基因检测探针和/或第二基因检测探针，所述第一基因检测探针与第一基因单链基因组DNA结合，所述第二基因检测探针与第二基因单链基因组DNA结合，同时在连接酶的作用下，基因检测探针发生环化，形成环化探针。5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤五中，所述环化探针以单链基因组DNA结合位置为起点，在聚合酶的作用下进行自我复制，产生大量的含重复序列的单链DNA；步骤六中，荧光探针结合在含重复序列的单链DNA上。6.如权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述第一基因为ETV6，所述第二基因为NTRK3，所述spacerguideRNA序列包含ETV6基因的识别序列或NTRK3基因的识别序列。7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述基因检测探针包括ETV6检测探针和/或NTRK3基因检测探针。8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述ETV6检测探针为SeqIDNO:5或SeqIDNO:6所示的核苷酸序列；所述NTRK3基因检测探针为SeqIDNO:7或SeqIDNO:8所示的核苷酸序列。9.一种融合基因原位检测试剂盒，所述融合基因至少包括第一基因和第二基因，其特征在于，通过权利要求1-8任一项所述的方法对第一基因和第二基因进行检测，包括通透处理体系、平末端处理体系、目的核酸暴露处理体系、探针锁定处理体系、信号放大处理体系、信号检测处理体系和洗液处理体系。10.如权利要求1-8任一项所述的融合基因原位检测方法及权利要求9所述的融合基因原位检测试剂盒，在癌细胞基因融合表达检测中的应用。2CN114075601A说明书1/7页一种融合基因原位检测方法、试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明涉及分子生物学和肿瘤学技术领域，具体涉及一种检测人ETV6-NTRK3融合基因的探针、试剂盒、检测方法及应用。背景技术[0002]近年来，随着分子病理诊断的快速发展。恶性肿瘤的诊断和治疗都有了很明显的进步。恶性肿瘤的发生发展往往是由于抑癌基因的失活和原癌基因的激活共同导致的。ETV6(全名:ETSvarianttranscriptionfactor6)基因编码ETS家族转录因子，位于12号染色体，该基因常参与引起血癌和先天性显微肉瘤的染色体重排。NTRK3(全名：neurotrophicreceptortyrosinekinase3)基因编码NTRK家族成员之一的蛋白，位于15号染色体，该基因的变异与髓母细胞瘤、分泌性乳腺癌和其他一些癌症相关。研究发现，ETV6-