一种用于检测靶基因是否发生融合突变的方法、引物组合、试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109234357A(43)申请公布日2019.01.18(21)申请号201811192208.2C40B50/06(2006.01)(22)申请日2018.10.12(71)申请人江苏先声医学诊断有限公司地址210000江苏省南京市溧水区白马镇康居路2-2号申请人南京先声医学检验有限公司(72)发明人张超李杜衡石亚辉陈斌任用(74)专利代理机构北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙)11371代理人刘丹丹(51)Int.Cl.C12Q1/6806(2018.01)C12Q1/6886(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书3页说明书16页附图8页(54)发明名称测。一种用于检测靶基因是否发生融合突变的方法、引物组合、试剂盒及其应用(57)摘要本发明涉及一种设计用于检测靶基因是否发生融合突变的引物组合的方法、引物组合、试剂盒及其应用。本发明所述引物设计方法沿可能的基因融合发生方向依次设计多条引物，组成引物组合，所述引物组合的引物沿基因融合发生的方向延伸，能够对发生未知融合的靶基因进行定向富集，克服现有扩增子测序方法无法靶向富集未知融合基因的缺点，有利于基因未知融合类型的发现和检测；同时，相邻两个引物之间的间隔为约0～130bp，对高度片段化的样本(如cfDNA、FFPE样本)的富集效果好。本发明还针对肺癌基因融合突变(包括ALK基因、NTRK1基因、RET基因、ROS1基因、FGFR3基因和NTRK3基因的融合突变)的检测设计引物组合，并对引物序列进行多轮检测和优化，最终获得对测序数据覆盖的均一性达85％以上，捕获效率达92％以上的引物组合，成CN109234357A功实现对多种肺癌基因未知融合突变的有效检CN109234357A权利要求书1/3页1.一种设计用于检测靶基因是否发生融合突变的引物组合的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)选择可能与其他基因发生融合的靶基因，确定所述靶基因上可能发生断裂融合的DNA区域；(2)预判断裂融合发生后，所述其他基因与所述靶基因的相对位置关系，根据所述相对位置关系设计引物组：a、如果融合后，所述其他基因位于所述靶基因的5’端，则沿所述DNA区域的正义链的3’端至5’端方向，依次设计多条3’端与所述正义链反向互补配对的引物，组成引物组1，其中，每条引物中与所述正义链反向互补配对的区域为靶基因结合区，相邻两条引物的靶基因结合区在所述正义链上间隔约0～130bp；b、如果融合后，所述其他基因位于所述靶基因的3’端，则沿所述DNA区域的反义链的3’端至5’端方向，依次设计多条3’端与所述反义链反向互补配对的引物，组成引物组2，其中，每条引物中与所述反义链反向互补配对的区域为靶基因结合区，相邻两条引物的靶基因结合区在所述正义链上的间隔约0～130bp；c、如果无法预判断裂融合发生后所述其他基因与所述靶基因的相对位置关系，则根据所述步骤a和所述步骤b设计所述引物组1和引物组2。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：(3)设计通用引物，所述通用引物分别与所述引物组1和/或引物组2组成用于靶向扩增的引物对，优选地，所述通用引物与接头序列中的至少一部分反向互补配对；优选地，所述步骤(2)与所述步骤(3)无先后顺序；优选地，所述方法还进一步包括以下步骤：(4)设计用于对靶向扩增产物进行再次扩增的上、下游引物；优选地，所述上游引物与所述通用引物相同，所述下游引物包括位于5’端的测序区、barcode区和位于3’端的延伸区，所述测序区用于引发测序引物延伸，所述延伸区与所述引物组1和/或所述引物组2中的每条引物的5’端反向互补配对。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述靶基因包括ALK基因、NTRK1基因、RET基因、ROS1基因、FGFR3基因和NTRK3基因中的一种或多种；优选地，所述靶基因包括ALK基因，所述ALK基因上可能发生断裂融合的DNA区域为：第2号染色体上第29446208～29448431位核苷酸；优选地，所述靶基因包括NTRK1基因，所述NTRK1基因上可能发生断裂融合的DNA区域为：第1号染色体上第156843425～156846364位核苷酸；优选地，所述靶基因包括RET基因，所述RET基因上可能发生断裂融合的DNA区域为：第10号染色体上第43606649～43607677位核苷酸，和/或第10号染色体上第43609004～43612179位核苷酸；优选地，所述靶基因包括ROS1基因，所述ROS1基因上可能发生断裂融合的DNA区域为：第6号染色体上第117641031～117658508位核苷酸；优选地，所述靶基因包括FGFR3基因，所