一种表达单元、重组慢病毒表达载体、重组慢病毒及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114134181A(43)申请公布日2022.03.04(21)申请号202110229999.7(22)申请日2021.03.02(71)申请人河南大学地址475004河南省开封市龙亭区金明大道北段(72)发明人王家富王婉至孟疆辉窦雨(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569代理人崔玥(51)Int.Cl.C12N15/867(2006.01)C12N15/57(2006.01)A61K48/00(2006.01)A61K38/48(2006.01)A61P29/00(2006.01)权利要求书1页说明书11页序列表3页附图3页(54)发明名称一种表达单元、重组慢病毒表达载体、重组慢病毒及其制备方法和应用(57)摘要本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达单元、重组慢病毒表达载体、重组慢病毒及其制备方法和应用。本发明合成了人源PIRT基因启动子序列和兔源RFT‑I最小启动子序列，并将切割SNARE的蛋白酶编码序列分别插入到这两个启动子下游，制备得到两种不同的重组慢病毒表达载体和病毒。本发明的慢病毒具备特异性抑制外周痛觉发生和信号传导的特点，有效切割了SNARE蛋白，抑制了痛觉神经递质的分泌，达到基因治疗疼痛的目的。CN114134181ACN114134181A权利要求书1/1页1.一种表达单元，其特征在于，所述表达单元包括启动子和外源基因；所述启动子为人源PIRT基因启动子或RFT‑I启动子。2.根据权利要求1所述的表达单元，其特征在于，所述外源基因为肉毒素蛋白酶基因或破伤风毒素蛋白酶基因。3.根据权利要求1所述的表达单元，其特征在于，所述人源PIRT基因启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述RFT‑I启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种重组慢病毒表达载体，其特征在于，所述重组慢病毒表达载体以慢病毒骨架载体SYN‑DsRed‑SYN‑GFP为基础，在多克隆位点插入权利要求1所述的表达单元。5.根据权利要求4所述的重组慢病毒表达载体，其特征在于，所述多克隆位点为NsiI和EcoRI的酶切位点。6.权利要求4或5所述的重组慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将人源PIRT基因启动子插入到SYN‑DsRed‑SYN‑GFP慢病毒骨架载体的NsiI与NheI酶切位点之间，得到SYN‑DsRed‑hPIRT‑GFP载体；2)将外源基因插入到SYN‑DsRed‑hPIRT‑GFP载体的NheI和EcoRI酶切位点之间，即得含hPIRT‑外源基因表达单元的重组慢病毒表达载体；3)将RFT‑I启动子插入到所述(2)重组慢病毒表达载体的NsiI与NheI酶切位点之间，即得含RFT‑I‑外源基因表达单元的重组慢病毒表达载体。7.包括权利要求4或5所述的重组慢病毒表达载体的重组慢病毒。8.权利要求7所述的重组慢病毒的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：将权利要求4或5所述的重组慢病毒表达载体与慢病毒包膜载体及包装载体共转染细胞系即得。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒包膜载体为pMD2.G；所述包装载体为psPAX2；所述细胞系为293T细胞。10.权利要求1‑3任意一项所述的表达单元、权利要求4‑5任意一项所述的重组慢病毒表达载体或权利要求7所述的重组慢病毒在制备治疗慢性疼痛药物中的应用。2CN114134181A说明书1/11页一种表达单元、重组慢病毒表达载体、重组慢病毒及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达单元、重组慢病毒表达载体、重组慢病毒及其制备方法和应用。背景技术[0002]疼痛是医学界的一个重要课题，许多疾病和创伤都伴着疼痛存在。疼痛会出现在患者身体的某个或多个部位，发病后会影响患者日常生活，心理状态，从而给患者带来一系列不愉快体验。1979年国际疼痛学会(IAPS)将疼痛定义为：一种令人不愉快的感觉和情绪上的感受，伴随有现存的或潜在的组织损伤。如若按照疼痛的时间和性质分类，疼痛可分为急性疼痛和慢性疼痛。其中，持续或反复发作超过三个月的称为慢性疼痛。慢性疼痛非常常见，影响着世界范围内约20％的人群。慢性疼痛包括癌性疼痛、神经病理性疼痛、偏头痛和内脏疼痛等。[0003]1990年9月14日，美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)的WilliamFrenchAnderson博士等获准实施人类历史上第一例基因治疗的临床试验。自此之后，基因治疗在治疗疾病中的巨大潜力被国内外学者重视起来，成为热门的生命科学研究方向之一。基因治疗指应用分子生物学技术导入外源基因，修复基因的缺陷，或纠正或补偿因基因的缺陷和