一种表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV载体、PRRS重组病毒及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115612693A(43)申请公布日2023.01.17(21)申请号202210772628.8A61K39/12(2006.01)(22)申请日2022.06.30A61P31/20(2006.01)(71)申请人肇庆大华农生物药品有限公司地址526238广东省肇庆市高新区创业路5号申请人华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司(72)发明人陈瑞爱温良海张古月黄梅(74)专利代理机构广州市越秀区哲力专利商标事务所(普通合伙)44288专利代理师陈奕(51)Int.Cl.C12N15/34(2006.01)C12N15/86(2006.01)C12N7/01(2006.01)权利要求书2页说明书27页附图6页(54)发明名称一种表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV载体、PRRS重组病毒及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV载体、PRRSV重组病毒及其构建方法和应用，属于生物技术领域，以PBR322作为基础载体，包括PRRSV基因组全长cDNA序列和p30蛋白基因序列，PRRSV基因组全长cDNA序列如SEQIDNo.1所示，p30蛋白基因序列插入到PRRSV基因组全长cDNA序列的ORF1b和ORF2a之间的区域，在插入p30蛋白基因序列的PRRSV基因组全长cDNA序列的上游设置位于CMV启动子，即得到表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV载体。该重组载体保真度高，构建便捷效率高。CN115612693ACN115612693A权利要求书1/2页1.一种表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV载体，以pBR322作为基础载体，包括PRRSV基因组全长cDNA序列和p30蛋白基因序列，其特征在于，所述p30蛋白基因序列插入到所述PRRSV基因组全长cDNA序列的ORF1b和ORF2a之间的区域，在插入所述p30蛋白基因序列的PRRSV基因组全长cDNA序列的上游设置位于CMV启动子，即得到如SEQIDNo.1所示表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV载体。2.根据权利要求1所述的一种表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV载体，其特征在于，所述p30蛋白基因序列的5’端引入kozak序列，所述p30蛋白基因序列的3’端引入TRS6序列，所述kozak序列如SEQIDNo.2所示，所述TRS6序列如SEQIDNo.3所示。3.根据权利要求1或2所述的一种表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV载体，其特征在于，将所述p30蛋白基因序列插入到所述PRRSV基因组全长cDNA序列的ORF1b和ORF2a之间的区域，包括以下步骤：PCR扩增pBR322‑CMV质粒，正向引物的序列如SEQIDNo.4所示，反向引物的序列如SEQIDNo.5所示，得到pBR322‑CMV线性片段，所述pBR322‑CMV质粒的序列如SEQIDNo.6所示；以pBR322‑CMV‑rJXA1R全长质粒为模板，如SEQIDNo.7所示序列为正向引物，如SEQIDNo.8所示序列为反向引物，PCR扩增得到4A扩增片段，以所述pBR322‑CMV‑rJXA1R全长质粒为模板，如SEQIDNo.9所示序列为正向引物，如SEQIDNo.10所示序列为反向引物，PCR扩增得到4B扩增片段，所述pBR322‑CMV‑rJXA1R全长质粒的序列如SEQIDNo.11所示；以pMD19‑P30质粒作为模板，如SEQIDNo.12所示序列为正向引物，如SEQIDNo.13所示序列为反向引物，PCR扩增得到p30蛋白基因片段，所述pMD19‑P30质粒序列如SEQIDNo.14所示，将所述pBR322‑CMV线性片段、所述4A扩增片段、所述4B扩增片段、所述p30蛋白基因片段进行同源重组，得到pBR322‑CMV‑segment4‑P30。4.根据权利要求3所述的一种表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV载体，其特征在于，以所述pBR322‑CMV线性片段为载体，所述4A扩增片段、所述4B扩增片段、所述p30蛋白基因片段为插入片段，所述载体和插入片段的摩尔比为1:2。5.根据权利要求1或2所述的一种表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV载体，其特征在于，将所述p30蛋白基因序列插入到所述PRRSV基因组全长cDNA序列的ORF1b和ORF2a之间的区域得到所述pBR322‑CMV‑segment4‑P30后，还包括以下步骤：以所述pBR322‑CMV‑rJXA1R全长质粒为模板，如SEQIDNo.15所示序列为正向引物，如SEQIDNo.16所示序列为反向引物，PCR扩增得到F1扩增片段；以所述pBR322‑CMV‑rJXA1R全长质粒