非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体、重组植物乳酸菌及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114426981A(43)申请公布日2022.05.03(21)申请号202210157630.4A61P31/20(2006.01)(22)申请日2022.02.21A23K10/18(2016.01)C12R1/25(2006.01)(71)申请人吉林农业大学地址130118吉林省长春市南关区2888号(72)发明人王春凤杨桂连邹博识牛天明杨文涛石春卫(74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司37221代理人李筝(51)Int.Cl.C12N15/74(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12N1/21(2006.01)A61K39/12(2006.01)A61K39/39(2006.01)权利要求书2页说明书31页序列表9页附图15页(54)发明名称非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体、重组植物乳酸菌及其制备方法和应用(57)摘要本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体、重组植物乳酸菌及其制备方法与应用，所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体包含P54、Fc、P30和EGP基因片段；其中，P54与P30为非洲猪瘟病毒基因II型SY‑18毒株中编码参与对宿主吸附和内化作用相关的胞膜结构蛋白基因序列；所述Fc为猪源IgG3Fc基因序列，EGP为肠道细胞HSPGs受体靶向配体多肽序列。本发明获得的重组植物乳杆菌能高效表达P54/P30抗原蛋白，具有良好的免疫原性。同时与原始菌株L.PlantarumNC8相比，能诱导黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答，具有良好的实际应用价值。CN114426981ACN114426981A权利要求书1/2页1.一种非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含P54、Fc、P30和EGP基因片段；其中，P54与P30为非洲猪瘟病毒基因II型SY‑18毒株中编码参与对宿主吸附和内化作用相关的胞膜结构蛋白基因序列；所述Fc为猪源IgG3Fc基因序列，EGP为肠道细胞HSPGs受体靶向配体多肽序列；优选地，所述重组表达载体为P54‑Fc‑P30‑EGP，P54、Fc、P30和EGP基因片段通过与pgsA’基因串联表达；进一步优选地，P54‑Fc‑P30‑EGP核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种重组植物乳杆菌，其特征在于，所述重组植物乳杆菌转化有权利要求1所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体；优选地，所述重组植物乳杆菌包含pgsA’锚定的P54、Fc、P30和EGP基因片段；所述P54、Fc、P30和EGP基因片段通过与pgsA’基因串联表达；进一步优选地，所述重组植物乳杆菌的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；更进一步地，所述重组植物乳杆菌编码蛋白其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种权利要求1或2所述重组植物乳杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：S1、将P54、Fc、P30和EGP基因片段插入锚定表达载体pSIP409‑pgsA’中，构建重组表达载体P54‑Fc‑P30‑EGP；S2、将步骤S1的重组表达载体转入植物乳杆菌中即得；优选地，步骤S1中，P54‑Fc‑P30‑EGP的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；P54‑Fc‑P30‑EGP编码蛋白其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；或者，步骤S2中，所述植物乳杆菌具体为植物乳杆菌NC8。4.一种非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体为：pLP‑S‑p14.5，pLP‑S‑p14.5‑IL‑33和pLP‑S‑CTA1‑p14.5‑D‑D；其中，p14.5为非洲猪瘟病毒编码p14.5蛋白的E120R基因序列；IL‑33为鼠源的IL‑33基因序列；CTA1‑DD为：基于霍乱毒素(CT)的酶活性CTA1亚单位和金黄色葡萄球菌蛋白A的D域二聚体人工构成的佐剂CTA1‑DD基因序列。5.如权利要求4所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体，其特征在于，pLP‑S‑p14.5的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；pLP‑S‑p14.5‑IL‑33的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；pLP‑S‑CTA1‑p14.5‑D‑D的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；优选地，pLP‑S‑p14.5编码蛋白其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；pLP‑S‑p14.5‑IL‑33编码蛋白其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；pLP‑S‑CTA1‑p14.5‑D‑D编码蛋白其氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。6.如权利要求4所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体的构建方法为：选取编码P14.5蛋白基因(E