靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体的构建与鉴定.docx

靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体的构建与鉴定
摘要
肿瘤细胞中存在着丰富的异常基因表达，其中ERG基因的高表达是多种人类癌症的特征。因此，对ERG基因在肿瘤中的生物学功能进行研究，具有重要的意义。在本研究中，我们利用重组慢病毒表达载体介导靶向人ERG基因的siRNA的转染，抑制ERG基因的表达，从而探究ERG基因在肿瘤细胞中的作用。研究结果表明：该载体能够成功地表达siRNA，并有效抑制ERG基因的表达。通过Westernblot和实时荧光定量PCR等方法，证实了ERG基因靶向干扰的有效性。因此，该重组慢病毒表达载体可为肿瘤治疗提供新的思路。
关键词：ERG基因；siRNA；慢病毒；表达载体；肿瘤治疗
一、引言
人ERG基因是Ets转录因子家族的成员之一，该基因编码140kD大小的蛋白，其C末端含有螺旋-环-螺旋结构域，N末端含有DNA结合结构域。ERG基因在正常情况下只在内皮细胞中表达，参与了正常血管发育和红细胞生产等生物学过程。但在肿瘤细胞中，ERG基因的高表达则与多种人类癌症发生和演化密切相关，如前列腺癌、恶性黑色素瘤等。
靶向干扰RNA（siRNA）是近年来发展起来的一种小分子RNA，具有选择性靶向基因的能力，并可通过RNA诱导反应（RNAi）逐步降低目标基因表达。因此，靶向ERG基因的siRNA治疗肿瘤具有一定前景。
慢病毒载体是在病毒基因组中删除了致病性相关因子并添加外源基因的修建慢病毒基因载体，在基因治疗和基因转导研究中得到了广泛应用。该载体能够在细胞中稳定表达目标基因，并且具有较高的转染效率和安全性。
本研究旨在构建一种靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体，并探究其是否具有抑制ERG基因表达的能力，为肿瘤治疗提供新的思路。
二、材料与方法
1.培养细胞
使用293T细胞和PC3细胞作为研究对象，均采用Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）附加10%FBS（Gibco）、100U/ml盘龙霉素（penicillin）和100μg/ml链霉素（streptomycin）来培养。293T细胞和PC3细胞均为常规培养，无需特殊处理。
2.参照序列
参考序列为人ERG基因序列（NM_001005380.2），录入NCBI数据库。
3.siRNA设计
利用NCBI的siRNA设计软件根据ERG基因序列设计siRNA。
4.siRNA重组慢病毒载体构建
将siRNA与慢病毒载体（pLVTHM）接合并转化到大肠杆菌DH5α中，挑选单个菌落进行扩增和测序验证后，用Endo-FreePlasmidMaxiKit纯化大量载体。
5.重组慢病毒包装
将慢病毒载体与三种包装质粒（pMD2.G,psPAX2和pLVTHM-siRNA）一同转染到293T细胞中，48小时后收集培养上清液，进行病毒包装和浓缩。
6.siRNA重组慢病毒转染
将PC3细胞接种于6孔板中，待细胞生长至80%以上时，加入重组慢病毒载体，进行转染。
7.Westernblot
采用Westernblot检测ERG基因的表达水平。
8.实时荧光定量PCR
采用实时荧光定量PCR检测ERG基因的表达水平。
三、结果
1.siRNA重组慢病毒载体构建
首先，我们利用NCBI提供的siRNA设计工具，针对人ERG基因设计了3个siRNA（siRNA1、siRNA2和siRNA3），经过序列比对和分析后，选择了一个具有较好抑制效果的siRNA设计序列（siRNA1）。然后，将siRNA1序列与慢病毒载体pLVTHM接合，经过转移、纯化和单克隆测序验证等步骤，最终得到siRNA重组慢病毒表达载体。
2.siRNA重组慢病毒抑制ERG基因表达
将siRNA重组慢病毒载体转染到人前列腺癌细胞株PC3中，经过48小时的培养后，采用Westernblot和实时荧光定量PCR等方法检测ERG基因表达水平。结果显示，与对照组相比，siRNA重组慢病毒组的ERG基因表达水平显著降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）。
四、讨论与结论
本研究利用靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体成功地抑制了ERG基因的表达，证明了该载体的有效性。ERG基因作为一种重要的转录因子，在肿瘤细胞中的高表达与多种人类癌症的发生和发展密切相关。因此，阻断ERG基因表达可能成为治疗ERG阳性肿瘤的一种新策略。
而siRNA作为一种新型的靶向干扰RNA技术，具有选择性强、特异性高的优势，可以降低目标基因的表达，进而影响细胞生长、分化或凋亡等生命过程。因此，构建靶向ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体，具有很好的应用前景。
综上所述，本研究构建的靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体具有可行性和有效性，能够为相关肿瘤的治疗提供新的思路和方向。但是，由于该载体的安全