一种植物重组表达载体及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114854787A(43)申请公布日2022.08.05(21)申请号202210396439.5A01H6/54(2018.01)(22)申请日2022.04.15(71)申请人中国农业科学院作物科学研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号(72)发明人邱丽娟郭勇金龙国郭兵福(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569专利代理师薛红凡(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N15/54(2006.01)C12N15/32(2006.01)C12N15/29(2006.01)C12N15/66(2006.01)A01H5/00(2018.01)权利要求书2页说明书8页序列表13页附图2页(54)发明名称一种植物重组表达载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明提供了一种植物重组表达载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。植物重组表达载体pGR20含有耐除草剂基因表达框、抗虫基因表达框和耐逆基因表达框。耐除草剂基因表达框包括CaMV35S启动子、优化密码子的g2m‑epsps基因和CaMVPolyA终止子，抗虫基因表达框包括CaMV35S启动子、优化密码子的cry1C基因和NOS终止子，耐逆基因表达框包括CaMV35S启动子、大豆GmNFYB1基因和NOS终止子。利用这一表达载体可获得耐除草剂抗虫耐逆复合性状的转基因植物，在培育复合性状植物品种中有良好的应用前景。CN114854787ACN114854787A权利要求书1/2页1.一种植物重组表达载体pGR20，其特征在于，包含耐除草剂基因表达框、抗虫基因表达框和耐逆基因表达框。2.根据权利要求1所述植物重组表达载体pGR20，其特征在于，所述耐除草剂基因表达框依次包含CaMV35S启动子、优化密码子的耐草甘膦基因和CaMVPolyA终止子；所述耐草甘膦基因包括g2m‑epsps；所述耐除草剂基因表达框如以下一种DNA片段：A.核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的DNA片段；B.与SEQIDNO:1互补的DNA片段；C.在SEQIDNO:1所示的DNA片段的基础上替换、缺失或插入一个或几个碱基形成的DNA片段。3.根据权利要求1所述植物重组表达载体pGR20，其特征在于，所述抗虫基因表达框依次包含CaMV35S启动子、优化密码子的抗虫基因和NOS终止子；所述抗虫基因包括cry1C；所述抗虫基因表达框的核苷酸序列如以下一种DNA片段：1)核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的DNA片段；2)与SEQIDNO:2互补的DNA片段；3)在SEQIDNO:2所示的DNA片段的基础上替换、缺失或插入一个或几个碱基形成的DNA片段。4.根据权利要求1所述植物重组表达载体pGR20，其特征在于，所述耐逆基因表达框依次包含CaMV35S启动子、大豆耐逆基因基因和NOS终止子；所述耐逆基因包括GmNFYB1；所述耐逆基因表达框如以下一种DNA片段：I核苷酸序列如SEQIDNO:3所示的DNA片段；II与SEQIDNO:3互补的DNA片段；III在SEQIDNO:3所示的DNA片段的基础上替换、缺失或插入一个或几个碱基形成的DNA片段。5.根据权利要求1～4任意一项所述植物重组表达载体pGR20，其特征在于，所述耐除草剂基因表达框的多克隆位点为XhoI；所述抗虫基因表达框的多克隆位点为KpnI/HindIII；所述耐逆基因表达框的多克隆位点为BglII/BstEII；所述重组表达载体pGR20的骨架载体包括pCAMBIA3301。6.根据权利要求5所述植物重组表达载体pGR20，其特征在于，所述pGR20的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。7.权利要求1～6任意一项所述植物重组表达载体pGR20的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：含BglII和BstEII酶切位点的GmNFYB1基因片段和商用载体pCAMBIA3301分别用BglII和BstEII双酶切后连接，构建出p3301‑NF载体；将抗虫基因cry1C和商用载体pBI121分别用BamHI和SacI双酶切后连接，构建出pBI121‑crylC载体；以所述pBI121‑crylC载体为模板，利用两端带有KpnI和HindIII酶切位点的特异性引物，扩增得到抗虫基因表达框的片段，与利用KpnI和HindIII酶切的p3301‑NF载体连接，构2CN114854787A权利要求书2/2页建p3301‑NF‑cry1C植物表达载体；利用序列合成的含有XhoI酶切位点的g2m‑epsps片段和所述p3301‑NF‑cry1C载体用XhoI酶切后连接，形成包含耐除草剂基因表达框的植物重组表达载体pGR20。8.权利要求1～6任一项所述植物重组