一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114958852A(43)申请公布日2022.08.30(21)申请号202210649544.5C12N15/22(2006.01)(22)申请日2022.06.09A01K67/027(2006.01)A61K49/00(2006.01)(71)申请人赛业（苏州）生物科技有限公司地址215400江苏省苏州市太仓市沙溪镇振溪路69号(72)发明人牟星(74)专利代理机构苏州市方略专利代理事务所(普通合伙)32267专利代理师石磊(51)Int.Cl.C12N15/113(2010.01)C12N9/22(2006.01)C12N15/85(2006.01)C12N15/89(2006.01)C12N15/21(2006.01)权利要求书2页说明书5页序列表1页附图2页(54)发明名称一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用(57)摘要本发明属于转基因技术领域，具体地涉及一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用，所述方法包括使用CRISPR‑Cas9靶向敲除小鼠Ifnar1基因，包括以下步骤：选择小鼠Ifnar1基因的外显子2作为敲除区域，crRNA设计在外显子2两边的内含子中；合成针对Ifnar1基因的crRNA1，序列如SEQIDN0.1所示；合成针对Ifnar1基因的crRNA2，序列如SEQIDN0.2所示。本发明利用CRISPR/Cas9系统能够快速高效的将目的Ifnar1基因大片段敲除，并且不留下外源基因片段。CN114958852ACN114958852A权利要求书1/2页1.一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括使用CRISPR‑Cas9靶向敲除小鼠Ifnar1基因。2.根据权利要求1所述的一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：合成针对Ifnar1基因的crRNA1，序列如SEQIDN0.1所示；合成针对Ifnar1基因的crRNA2，序列如SEQIDN0.2所示。3.根据权利要求2所述的一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，选择小鼠Ifnar1基因的外显子2作为敲除区域，crRNA设计在外显子2两边的内含子中。4.根据权利要求3所述的一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：从NCBI数据库中下载小鼠Ifnar1基因的核苷酸序列，并进行同源比对。5.根据crRNA的PAM设计原则及同源比对的结果，合成了crRNA1和crRNA2，序列分别为：crRNA1=SEQIDNO.1=5’‑GUAGGUGAAUCAGUAGGGACGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG‑3，crRNA2=SEQIDNO.2=5’‑UACAAGUUUAGCUCAUGGACGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG‑3'。6.根据权利要求4所述的一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)合成针对Ifnar1基因的crRNA，包括crRNA1和crRNA2，crRNA1序列如SEQIDN0.1所示；crRNA2序列如SEQIDN0.2所示；2)PMSG处理C57BL/6雌性小鼠，再注射hCG，与雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵进行显微注射，将步骤1)所述的crRNA与tracrRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0小鼠；3)提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序，鉴定是否为嵌合体；4)待雄性F0小鼠到8周龄，雌性小鼠到6周龄，可分别与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，小鼠出生14天后PCR鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞。7.根据权利要求4所述的一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤2）包括：PMSG处理C57BL/6雌性小鼠，再注射hCG，与雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵进行显微注射，将步骤1)所述的crRNA和tracrRNA与Cas9蛋白共注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，胚胎移植的小鼠将会在手术后19‑21天出生，即为F0代小鼠，待小鼠出生7天后剪尾提取DNA并进行PCR鉴定，DNA抽提及PCR检测时间为2‑3天，整个步骤2）实验周期28‑31天。8.根据权利要求4所述的一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤3）包括：待雄性Founder小鼠到8周龄，雌性小鼠到6周龄，可分别与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，小鼠出生14天后PCR鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞，这个过程耗时