双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105420154A(43)申请公布日2016.03.23(21)申请号201510946072.XC12R1/01(2006.01)(22)申请日2015.12.16(71)申请人清华大学地址100084北京市海淀区100084-82信箱(72)发明人于慧敏孙继哲陈杰罗晖沈忠耀(74)专利代理机构北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)11201代理人李志东(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)C12N15/74(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12P13/02(2006.01)权利要求书2页说明书12页序列表6页附图4页(54)发明名称双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种构建双基因敲除的重组红球菌的方法，包括：(1)根据红球菌的腈水合酶基因序列，设计引物以分别扩增腈水合酶基因的上游序列和下游序列，获得腈水合酶基因的上游片段和下游片段；(2)将腈水合酶基因的上游片段和下游片段插入到自杀质粒中，获得重组自杀质粒，自杀质粒携带卡那霉素抗性基因和蔗糖果聚糖酶基因；(3)利用重组自杀质粒转化敲除了酰胺酶基因的重组红球菌的感受态细胞，获得双基因敲除的重组红球菌，其中包括，通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选，获得第一重组菌落，通过蔗糖平板对第一重组菌落进行第二轮筛选。还公开一种高表达腈水解酶的重组红球菌及其构建方法、以及一种制备丙烯酸铵的方法。CN105420154ACN105420154A权利要求书1/2页1.一种构建双基因敲除的重组红球菌的方法，其特征在于，包括：(1)根据所述红球菌的腈水合酶基因序列，设计引物以分别扩增所述腈水合酶基因的上游序列和所述腈水合酶基因的下游序列，获得所述腈水合酶基因的上游片段和所述腈水合酶基因的下游片段；(2)将(1)中的腈水合酶基因的上游片段和腈水合酶基因的下游片段插入到自杀质粒中，获得重组自杀质粒，所述自杀质粒携带卡那霉素抗性基因和蔗糖果聚糖酶基因；(3)利用(2)中的重组自杀质粒转化敲除了酰胺酶基因的重组红球菌的感受态细胞，获得所述双基因敲除的重组红球菌，其中包括，通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选，获得第一重组菌落，通过蔗糖平板对所述第一重组菌落进行第二轮筛选，以获得所述双基因敲除的重组红球菌。2.权利要求1的方法，其特征在于，(1)中的腈水合酶基因的上游片段带有酶切位点EcoRI/XbaI，(1)中获得的腈水合酶基因的下游片段带有酶切位点XbaI/HindIII；任选的，(1)中的扩增所述腈水合酶基因的上游片段的引物具有如SEQIDNO：1和2所示的序列，所述腈水合酶基因的上游片段具有如SEQIDNO：3所示的序列，和/或(1)中的扩增所述腈水合酶基因的下游片段的引物具有如SEQIDNO：4和5所示的序列，所述腈水合酶基因的下游片段具有如SEQIDNO：6所示的序列。3.权利要求1的方法，其特征在于，(2)中的自杀质粒选自pk18mob-sacB和其衍生质粒中的一种；任选的，(3)为利用电穿孔进行所述重组自杀质粒转化。4.权利要求1的方法，其特征在于，(3)中的通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选，获得第一重组菌落，包括：利用含卡那霉素20微克/毫升的LB固体平板进行所述第一轮筛选，获得在所述卡那霉素20微克/毫升的LB固体平板上生长的红色菌落。5.权利要求4的方法，其特征在于，(3)中的通过蔗糖平板对所述第一重组菌落进行第二轮筛选，以获得所述双基因敲除的重组红球菌，包括：利用含蔗糖10％的LB固相平板对所述红色菌落进行所述第二轮筛选，获得在含蔗糖10％的LB固相平板上生长的菌落，分别通过含卡那霉素20微克/毫升的LB固体平板和不含卡那霉素的LB固相平板对所述在含蔗糖10％的LB固相平板上生长的菌落进行筛选，获得在所述含卡那霉素20微克/毫升的LB固体平板上不生长、在所述不含卡那霉素的LB固体平板上生长的菌落为所述双基因敲除的重组红球菌。6.一种双基因敲除的重组红球菌，其利用权利要求1-5任一方法构建获得。7.一种构建高表达腈水解酶重组红球菌的方法，其特征在于，包括：构建高表达腈水解酶的质粒，获得高表达腈水解酶质粒；利用所述高表达腈水解酶质粒转化权利要求6的双基因敲除的重组红球菌的感受态细胞，以获得所述高表达腈水解酶重组红球菌。8.权利要求7的方法，其特征在于，所述构建高表达腈水解酶的质粒包括：设计引物对以扩增紫红红球菌的腈水解酶基因，获得腈水解酶基因扩增产物，2CN105420154A权利要求书2/2页将所述腈水解酶基因扩增产物插入到大肠杆菌-红球菌穿梭质粒中，以获得所述高表达腈水解酶质粒；任选的，所述引物对具有如SEQIDNO：7和8所示的序列；任选的，所述腈