Bag5基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927455A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202210715706.0C12N15/89(2006.01)(22)申请日2022.06.22A01K67/027(2006.01)A61K35/52(2015.01)(71)申请人华中科技大学A61P15/08(2006.01)地址430030湖北省武汉市华中科技大学同济医学院航空路13号(72)发明人袁水桥甘世明熊孟能周淑敏熊欣欣范旭刘款杨诗语江楠(74)专利代理机构深圳市圳博友邦专利代理事务所(普通合伙)44600专利代理师陈烈军(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N15/55(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图12页(54)发明名称Bag5基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用(57)摘要本发明首次公开了Bag5基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用，属于生物技术领域。构建方法包括：通过高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术，根据Bag5基因序列确定Bag5小鼠待敲除基因的两条特异性靶点gRNA1和gRNA2，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA，显微注射入小鼠受精卵并移植至代孕母鼠输卵管内，待产出小鼠后传代培养，经基因型鉴定得到稳定遗传的Bag5基因敲除小鼠动物模型。本发明首次在Bag5敲除小鼠模型中鉴定出无头精子症的不可育表型，通过ICSI技术，将精子头注射入发育良好的卵细胞内，成功使不育小鼠再次生出后代，为研究临床上的无头精子症患者提供了Bag5基因敲除小鼠动物模型，为无头精子症疾病的作用机制和治疗提供依据，并验证了Bag5基因的突变筛选在预防无头精子症中的应用。CN115927455ACN115927455A权利要求书1/1页1.Bag5基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)根据Bag5基因序列确定Bag5小鼠待敲除基因的两条特异性靶点gRNA1和gRNA2，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA；(2)将两条特异性靶点gRNA1和gRNA2的mRNA和Cas9的mRNA一起显微注射入小鼠受精卵内，显微注射后的受精卵移植至代孕母鼠输卵管内；(3)待产出小鼠后继续传代培养，经基因型鉴定，得到稳定遗传的Bag5基因敲除小鼠动物模型；其中，所述gRNA1的靶点序列如SEQIDNO:1所示，所述gRNA2的靶点序列如SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的Bag5基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述基因型鉴定为：若为一个271bp的条带，为阳性纯合子；若为663bp和271bp的两个条带，为阳性杂合子；若为一个271bp的条带，为野生型对照。3.根据权利要求2所述的Bag5基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中，显微注射后的受精卵移植至代孕母鼠输卵管内，产出小鼠，即为F0代小鼠；提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物测序，阳性小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代阳性杂合子小鼠，F1代阳性杂合子小鼠杂交获得F2代阳性纯合子小鼠。4.Bag5基因敲除小鼠动物模型，其特征在于：通过权利要求1至3任一项所述Bag5基因敲除小鼠动物模型的构建方法得到该模型。5.Bag5基因敲除小鼠动物模型的应用，其特征在于：Bag5基因缺失会导致无头精子症不育表型。6.Bag5基因敲除小鼠动物模型的应用，通过卵胞浆内单精子显微注射技术成功挽救Bag5基因缺失导致的无头精子症不育表型，其特征在于：包括以下步骤：(1)从无头精子症的小鼠附睾尾中释放出精子头；(2)提前准备好供卵母鼠，取出卵细胞；(3)通过显微注射技术用微量吸液管的细针将单个精子注入到卵细胞的中央；等待受精结束后，观察受精卵的发育状态包括二细胞胚胎，囊胚以及是否能够产生后代，其中，若成功发育成二细胞，囊胚和产生后代，即为成功挽救Bag5基因缺失导致的无头精子症不育表型。7.Bag5基因在筛选基因突变导致的无头精子症中的应用。2CN115927455A说明书1/7页Bag5基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，尤其涉及Bag5基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用。背景技术[0002]BCL2相关的athanogene5预测使腺苷酸‑核苷酸交换因子活性；伴侣结合活性；和酶结合活性。预计参与多个过程，包括细胞蛋白质代谢过程的负调控；蛋白质重折叠的负调控；和蛋白质稳定。预计位于包涵体中；线粒体；和细胞质的核周区。预计在胞质溶胶、膜和核中有活性。与人类Bag5(Bagcochaperone5)直系同源。[0003]根据估计，由男性因素导致的不孕夫妇逐年增长