一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株及其构建方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102115718A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102115718A(43)申请公布日2011.07.06(21)申请号201010591434.5(22)申请日2010.12.16(71)申请人南京工业大学地址210009江苏省南京市新模范马路5号(72)发明人严明安芳芳郝宁李艳许琳魏淼王珊珊刘欢(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙)32204代理人肖明芳(51)Int.Cl.C12N1/19(2006.01)C12N15/56(2006.01)C12N9/38(2006.01)C12R1/84(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图4页(54)发明名称一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株及其构建方法和应用。克隆得到ThermusthermophilusHB27半乳糖苷酶基因bgal，并将其插入到真核表达载体pPIC9K上，转化毕赤酵母菌株GS115内，可得到β-半乳糖苷酶表达量达到14000U/ml。β-半乳糖苷酶基因bgal表达的分子量为58Dk，最适温度为70℃，其最适温度下很稳定。在pH6.5时该乳糖酶水解活力最高，而且稳定性较好。高效表达的β-半乳糖苷酶可直接用于乳制品的巴氏消毒法，可以做到灭菌的同时降解乳糖，避免了灭菌后添加酶所造成的二次污染。在60度，30分钟，HB27半乳糖苷酶可以降解牛奶90％的乳糖。CN102578ACCNN110211571802115720A权利要求书1/1页1.一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株，其特征在于该菌株为基因组DNA上整合了来源于嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)HB27的β-半乳糖苷酶基因bgal的毕赤酵母。2.权利要求1所述的表达β-半乳糖苷酶的重组菌株的构建方法，其特征在于将来自嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)HB27的β-半乳糖苷酶基因bgal克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，利用SacI限制性内切酶线性化载体后，将其转化至毕赤酵母中，利用G418抗生素进行多拷贝转化子筛选得到。3.权利要求1所述的表达β-半乳糖苷酶的重组菌株高效表达β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于以甲醇为诱导剂诱导培养重组菌株产酶，每3L发酵液培养菌体生长35h，OD600达到450后，以流加形式加入甲醇，加入总量为1.0～1.5L的甲醇，诱导时间为40～48h。4.权利要求1所述的表达β-半乳糖苷酶的重组菌株，发酵生产的β-半乳糖苷酶在巴氏消毒法的应用。2CCNN110211571802115720A说明书1/6页一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明涉及一种表达β-半乳糖苷酶的重组菌株及其构建方法和应用，属于生物技术领域。背景技术[0002]β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)学名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(以下简称半乳糖苷酶)，常用名为乳糖酶，该酶能将乳糖水解成为半乳糖与葡萄糖。[0003]半乳糖苷酶最早用于乳制品产业，由于牛奶在西方人的饮食结构中占有很大比重，所以国外对半乳糖苷酶的研究较早，许多研究工作主要集中在低乳糖奶加工和乳糖不耐症(LactoseIntolerance)的诊断治疗上。乳糖是哺乳动物乳汁中特有的糖类，哺乳动物乳汁中乳糖含量因种类而异，人乳中乳糖含量为6.7％.，牛乳中乳糖平均含量为4.5-5％。尽管牛乳及其乳制品具有“近乎完美的食物”的美誉，但在我国，乳制品的发展仍处于初级阶段，其中乳糖不耐症是限制其发展的主要原因之一。由于乳糖需经过由小肠粘膜上皮细胞分泌的半乳糖苷酶水解成半乳糖和葡萄糖后才能被人体吸收利用，所以乳糖不耐症的病因主要是由于小肠粘膜上半乳糖苷酶活力较低所致。牛乳中乳糖得不到水解，小肠内乳糖浓度提高，使渗透压增高，从而导致进入肠腔内的水分含量提高，其产生的症状是腹部压力增高、气胀、腹痛和腹泻。绝大多数哺乳动物出生之后小肠粘膜乳糖酶活性较高，可以消化吸收来自母乳或其他乳制品的乳糖，断乳之后，乳糖酶活性随年龄增长逐渐下降，到成人之后半乳糖苷酶活性仅为正常婴儿水平的5-10％，并逐渐发展成为乳糖不耐症。据统计乳糖不耐症影响着全世界约70％的人(尤其是亚洲和非洲人)对乳的摄入。[0004]生产低乳糖奶，是目前克服乳糖不耐症的最好方法。经典方法是将新鲜牛乳经巴氏灭菌后，冷却至40-45℃，加入半乳糖苷酶并保温，使乳糖水解。研究发现当乳糖水解率为70-80％时，既能解决乳糖不耐症问题，又能生产出风味良好的产品。低乳糖奶的生产国外早已商业化，国内则刚起步。低乳糖奶的生产方式有多种，上述只是其中多生产方法中的一种。从理论上讲，低乳糖奶生产方法有