一种重组菌株及其构建方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110157722A(43)申请公布日2019.08.23(21)申请号201910477728.6(22)申请日2019.06.03(71)申请人廊坊梅花生物技术开发有限公司地址065001河北省廊坊市开发区华祥路66号(72)发明人胡丹王成薛婷莉吴涛(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人刘伟赵青朵(51)Int.Cl.C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12N9/24(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图1页(54)发明名称一种重组菌株及其构建方法与应用(57)摘要本发明属于生物化工技术领域，公开了一种重组载体，含有编码嘌呤碱基的DNA分子的载体；其中所述编码嘌呤碱基的DNA分子5’端连接有一个额外的起始密码子。所述重组载体转化宿主菌株获得重组菌株。本发明通过在编码嘌呤碱基的DNA分子引入双起始密码子，可有效提高基因的表达水平，通过pET系统异源表达本发明重组载体中的核苷水解酶基因，可获得高活力的核苷水解酶，相同制备条件获得更高活力的核苷水解酶，进而可提高水解腺苷和鸟苷效率，获得更多嘌呤碱和D-核糖。CN110157722ACN110157722A权利要求书1/1页1.一种重组载体，含有编码嘌呤碱基的DNA分子的载体；其中所述编码嘌呤碱基的DNA分子5’端连接有一个额外的起始密码子。2.根据权利要求1所述的重组载体，所述起始密码子为ATG。3.根据权利要求1所述的重组载体，所述编码嘌呤碱基的DNA分子为大肠杆菌BL21(DE3)的rihC基因序列或布氏锥虫菌的iagnh基因序列。4.根据权利要求1所述的重组载体，所述载体为pET24a载体。5.权利要求1所述重组载体的构建方法，利用Phusion超保真聚合酶，通过PCR扩增在编码嘌呤碱基的DNA分子中引入一个额外ATG起始密码子，与载体连接后获得重组载体。6.一种含有权利要求1-4任意一项所述重组载体的重组菌株。7.根据权利要求6所述的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。8.权利要求6或7所述重组菌株在发酵生产核苷水解酶中的应用。9.一种核苷水解酶的生产方法，其特征在于，将权利要求6或7所述重组菌株发酵培养收集菌体，破碎收集上清液核苷水解酶粗酶液。2CN110157722A说明书1/5页一种重组菌株及其构建方法与应用技术领域[0001]本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种重组载体、重组菌株及其构建方法与应用，尤其是涉及一种提高表达的核苷水解酶体外催化活性的重组载体、重组菌株及其构建方法与应用。背景技术[0002]嘌呤碱基是一种碱基化合物。是生物体中核酸(DNA，RNA)和一些小分子的核苷酸重要组成部分。在生物学中常见的有：鸟嘌呤(G)，腺嘌呤(A)。[0003]腺嘌呤也称6-氨基嘌呤，是核酸的组成成分，参与遗传物质的合成。腺嘌呤分子式C5H5N5，分子量135.1，其性状为白色针状结晶，溶于酸和碱，微溶于醇，水溶液呈中性。腺嘌呤能促进白细胞增生，使白细胞数目增加，用于防治各种原因引起的白细胞减少症，特别是用于放射治疗、苯中毒和抗肿瘤等引起的白细胞减少症，也用于急性粒细胞减少症，医药及生化研究。腺嘌呤作为重要的医药原料，主要用于生产抗乙肝药物阿德福韦酯和抗艾滋病药物泰诺福韦酯，及植物生长激素6-苄基腺嘌呤等医药产品。鸟嘌呤(2-氨基-6-羟基嘌呤、2-氨基次黄嘌呤，C5H5N5O)是一系列高效低毒的抗疱疹药物阿昔洛韦、泛昔洛韦等药物的重要中间体。[0004]腺嘌呤有3种生产方法：化学合成法、酸水解法、酶催化法。化学合成法是由4,6-二氯-5-硝基嘧啶用氨水氨化得到4,6-二氨基-5-硝基嘧啶，再与甲酸、甲酰氨和硫代硫酸钠一起环化而得。化学合成法反应步骤长、收率低、反应条件苛刻、对设备要求高，且环境不友好。酸水解法是以腺苷为原料，经盐酸水解和氨水中和，获得腺嘌呤。酸水解法是目前的主流方法，收率高，但母液处理困难。酶催化法是以腺苷为底物，加入核苷水解酶进行催化反应，可同时获得腺嘌呤和D-核糖。酶催化法高效、快捷、安全、无污染，且生产成本低，非常有竞争优势。[0005]同样鸟嘌呤也可以使用化学法和酶催化的方法制备。化学法可以用2，4，5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐、甲酸和甲酰胺制备鸟嘌呤，其缺点为原料损失大，鸟嘌呤精制困难，操作繁琐，工艺复杂，对设备要求高，且环境不友好。酶解法是在一定条件下，核苷水解酶可以水解N-糖基键将鸟苷水解成鸟嘌呤和D-核糖。利用这一技术可以高效、快捷、安全、无污染的制备鸟嘌呤和D-核糖。[0006]核苷水解酶能分解核苷生成含氮碱基和戊糖。核苷水解酶是酶解法制备嘌呤碱基的关键物质。目前核苷水解酶主