重组菌株及其构建方法、应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105670982A(43)申请公布日2016.06.15(21)申请号201610119078.4C12R1/13(2006.01)(22)申请日2016.03.02(83)生物保藏信息CGMCCNo.119382015.12.25(71)申请人廊坊梅花生物技术开发有限公司地址065001河北省廊坊市开发区华祥路66号(72)发明人朱亚然毛贤军刁刘洋(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人赵青朵(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12P13/08(2006.01)C12R1/15(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表5页附图1页(54)发明名称重组菌株及其构建方法、应用(57)摘要本发明涉及微生物领域，特别涉及重组菌株及其构建方法、应用。本发明保护将目标基因以重组质粒或插入染色体等方式导入棒杆菌或短杆菌得到的工程菌株。摇瓶发酵生产L-缬氨酸实验结果表明：出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为3.2g/L，而本发明的工程菌MHZ-1011的L-缬氨酸产量为6.5g/L，比出发菌株产量提高103％，具有极显著差异(P＜0.01)。50L罐发酵生产L-缬氨酸实验结果表明：出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为7.3g/L，而本发明的工程菌MHZ-1011的L-缬氨酸产量为18.4g/L，比出发菌株产量提高152％，具有极显著差异(P＜0.01)。CN105670982ACN105670982A权利要求书1/1页1.重组菌株，其特征在于，由编码gapN蛋白质的gapN基因导入生产L-缬氨酸的原始菌株制得；所述原始菌株为棒杆菌或短杆菌。2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述原始菌株选自谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、北京棒杆菌(C.pekinense)和黄色短杆菌(B.flavum)。3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述生产L-缬氨酸的原始菌株为保藏编号为CGMCC1.299的谷氨酸棒杆菌。4.根据权利要求1至3任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述编码gapN蛋白质的gapN基因以重组质粒或插入染色体的方式导入所述原始菌株。5.根据权利要求1至4任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述编码gapN蛋白质的gapN基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端第1至1428位核苷酸所示。6.根据权利要求4或5所述的重组菌株，其特征在于，所述重组质粒的制备方法为将所述gapN基因的核苷酸序列插入出发载体pXMJ19的多克隆位点。7.根据权利要求1至6任一项所述的重组菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.11938。8.根据权利要求1至7任一项所述的重组菌株发酵生产缬氨酸中的应用。9.一种如权利要求1至7任一项所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，将编码gapN蛋白质的gapN基因导入生产L-缬氨酸的原始菌株；所述原始菌株为棒杆菌或短杆菌。10.一种发酵生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，发酵菌株为根据权利要求1至7任一项所述的重组菌株或如权利要求9所述构建方法构建的重组菌株。2CN105670982A说明书1/6页重组菌株及其构建方法、应用技术领域[0001]本发明涉及微生物领域，特别涉及重组菌株及其构建方法、应用。背景技术[0002]L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C5H11NO2，相对分子质量为117.15。呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中溶解度：25℃为88.5g/L，50℃为96.2g/L，不溶于冷乙醇，乙醚，丙酮。等电点为5.96，熔点315℃。[0003]L-缬氨酸(L-Val)是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸(包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。[0004]医药工业中，可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。如缺乏可引起神经障碍、停止发育、体重下降、贫血等。[0005]食品工业中，可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。米制糕饼中添加缬氨酸(1g/kg)，产品有芝麻香，用于面包亦能改善风味。L-缬氨酸也可用作氨基酸能量饮料与运动员饮料，有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。[0006]饲料工业中，对动物的乳腺组织分泌乳汁有重要的促进作用。将其用于雏鸡饲料中，可提高雏鸡对鸡新城疫病毒的免疫能力。而且L-缬氨酸是动物饲料中的一种限制性氨基酸，所以L-缬氨酸可作为饲料添加剂改善动物日粮中氨基酸含量的不足。[0007]L-缬氨酸的