一种无乳链球菌菌株ΔessC及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115044599A(43)申请公布日2022.09.13(21)申请号202110258126.9C12N15/31(2006.01)(22)申请日2021.03.09C12R1/46(2006.01)(71)申请人广东省农业科学院动物卫生研究所地址510640广东省广州市天河区五山白石岗街申请人广东顺安丰泰水产科技有限公司(72)发明人马艳平刘振兴吴梓鋆郝乐马江耀梁志凌柯浩(74)专利代理机构广州广典知识产权代理事务所(普通合伙)44365专利代理师万志香顾书玲(51)Int.Cl.C12N15/74(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12N15/66(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表10页附图5页(54)发明名称一种无乳链球菌菌株ΔessC及其构建方法和应用(57)摘要本发明涉及一种essC基因敲除的无乳链球菌菌株ΔessC及其构建方法和应用，所述essC基因序列如SEQIDNO.1所示，或为与SEQIDNO.1完全互补配对的序列，或为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。经研究发现essC基因缺失造成了分泌免疫原性胞外蛋白ESAT6产生分泌障碍，从而降低了无乳链球菌株毒性。同时，本发明所构建的无乳链球菌基因敲除菌株ΔessC与野生株生长速率基本一致，且具有明显减毒特征，本研究对无乳链球菌Ⅶ型分泌系统的研究提供了理论基础，为寻找抗无乳链球菌基因蛋白药物的作用靶点提供关键性线索。CN115044599ACN115044599A权利要求书1/1页1.一种essC基因在无乳链球菌毒性调控中的应用，其特征在于，所述essC基因序列如SEQIDNO.1所示，或为与SEQIDNO.1完全互补配对的序列，或为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。2.一种essC蛋白在无乳链球菌毒性调控中的应用，其特征在于，所述essC蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，或如SEQIDNO.2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。3.根据权利要求1‑2中任一项所述应用，其特征在于，所述毒性表现为分泌免疫原性胞外蛋白，优选为分泌ESAT6蛋白。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述毒性调控为正向调控，优选为essC基因敲除下调无乳链球菌ESAT6蛋白表达。5.一种essC基因重组敲除载体，其特征在于，所述重组载体上插入以氯霉素抗性基因CAT代替essC基因的融合片段，所述融合片段由如权利要求1所示essC基因的上、下游片段和CAT基因片段组成。6.根据权利要求5所述重组敲除载体，其特征在于，所述essC基因上游片段为其上游632bp同源臂，所述essC基因下游片段为其下游571bp同源臂。7.一种essC基因重组敲除载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以无乳链球菌基因组DNA为模板，以SEQIDNO.3‑SEQIDNO.4为引物对PCR扩增essC基因上游片段essCup，以SEQIDNO.5‑SEQIDNO.6为引物对PCR扩增essC基因下游片段essCdown；以质粒pSET5S为模板，以SEQIDNO.7‑SEQIDNO.8为引物对PCR扩增氯霉素抗性基因片段CAT；(2)将步骤(1)得到的三个片段经纯化后进行融合PCR扩增；(3)将步骤(2)验证得到的融合酶切后连接至线性化载体pSET4s，连接产物转化后经鉴定，筛选，即得。8.权利要求5‑6中任一项所述essC基因重组敲除载体在调控无乳链球菌毒性中的应用。9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述毒性调控为essC基因敲除下调无乳链球菌ESAT6蛋白表达。10.一种essC基因敲除的无乳链球菌菌株ΔessC，其特征在于，所述ΔessC为无乳链球菌中的essC基因存在缺失，缺失的essC基因序列如SEQIDNO.1所示，或为与SEQIDNO.1完全互补配对的序列，或为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。2CN115044599A说明书1/7页一种无乳链球菌菌株ΔessC及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明涉及属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种无乳链球菌菌株ΔessC及其构建方法和应用。背景技术[0002]无乳链球菌(Streptococcusa