牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103197082A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103197082103197082A(43)申请公布日2013.07.10(21)申请号201310136066.9(22)申请日2013.04.16(71)申请人深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心地址518045广东省深圳市福强路1011号(72)发明人杨俊兴花群义曹琛福张彩虹吕建强卢体康孙洁陈兵阮周曦秦智锋刘建利胡运发唐金明(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书7页说明书7页序列表3页序列表3页附图1页附图1页(54)发明名称牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种用于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体检测的重组抗原及其快速检测试纸条。其主要针对于BVDV抗体检测的截短的BVDVNS表达抗原和用于检测BVDV抗体的快速检测试纸条。利用抗原表位分析软件，对BVDVNS蛋白氨基酸序列分析，取含有主要抗原表位的片段，根据其对应核苷酸序列设计引物，通过PCR扩增、重组表达载体构建和原核表达，获得了截短BVDVNS重组抗原，纯化后可用于BVDV抗体检测。基于截短的BVDVNS抗原建立的快速检测试纸条，该试纸条具有操作方便、检测快速，且不需专门实验室和设备等优点，克服了现有检测方法的局限，可用于BVDV抗体的快速检测和血清流行病学调查。CN103197082ACN1039782ACN103197082A权利要求书1/1页1.一种用于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体检测的快速检测试纸条。其特征在于使用了截短的BVDVNS基因工程表达抗原作为检测线试剂。2.根据权利要求1中所述的，截短的NS片段是通过使用抗原表位分析软件分析后选择长度为261个氨基酸的片段，其氨基酸序列为序列表中SEQIDNo.1。3.根据权利要求1中所述的，截短的BVDVNS抗原是通过对PCR扩增BVDVNS基因片段，该基因片段序列为序列表中SEQIDNo.2，将扩增的基因片段插入pET52/LIC载体中，构建pET52/LIC-BVDVNS重组表达载体，将载体转化BL21大肠杆菌，进行表达所得到的重组蛋白抗原，该重组抗原可用于BVDV抗体检测。4.根据权利要求3所述的截短的BVDVNS抗原，是根据其对应的核苷酸序列，设计特异性引物，并在引物的5′端分别加入LIC位点，其序列为序列表中SEQIDNo.3和SEQIDNo.4。5.根据权利要求1中所述的BVDV抗体检测的快速检测试纸条可以用于BVDV抗体的快速检测。2CN103197082A说明书1/7页牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及动物病毒学和动物传染病学领域，具体是一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的快速检测试纸条及其制备方法。背景技术[0002]牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhoea，BVD)又称为牛病毒性腹泻/粘膜病(Bovineviraldiarrhoea-mucosaldisease，BVD-MD)，是由牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrhoeavirus，BVDV)引起的主要发生于牛的一种接触性传染病。BVDV与猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)、羊边界病病毒(borderdiseasevirus，BDV)及部分未分类瘟病毒同属于黄病毒科瘟病毒属，均为单股正链RNA病毒。瘟病毒属成员中的病毒过去被认为是宿主特异性的，但后来的研究表明BVDV与BDV可以感染更广泛的宿主，它们不但可以感染牛和羊，并且可以感染包括猪在内的多种偶蹄类动物。[0003]目前，BVD广泛分布于世界各国，如美国血清学阳性率约50％，加拿大82％，澳大利亚89％，法国76％，英格兰54％～74％，芬兰大于50％，瑞士78％～80％，印度17.3％，南美6国(巴西、智利、阿根廷、哥伦比亚、乌拉圭和秘鲁)阳性率达84％。该病在我国绝大多数省份均有报道，在部分地区，BVDV血清抗阳性率达80％以上。在国际动物贸易中，很多国家规定BVD是必须检疫的动物疫病之一。BVD的广泛存在严重影响着动物养殖业的健康发展和国际动物贸易，造成巨大的经济损失。BVDV引起的牛病毒性腹泻-黏膜病迄今尚无有效的治疗方法，且疫苗预防效果不理想。BVDV可以造成免疫耐受和持续性感染，这给该病的检疫带来了很大的困难。[0004]目前，检测BVD的方法主要为病毒分离、中和试验、琼脂扩散试验，这些方法操作繁琐、费时。RT-PCR方法虽然特异性和敏感性都很高，但需要专门的仪器设备和技术人员，只能用于实验室检测。因此，这些方法均不适用于现场检测和基层兽医