牛病毒性腹泻病毒纳米抗体及其制备方法及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116023479A(43)申请公布日2023.04.28(21)申请号202210903051.X(51)Int.Cl.(22)申请日2021.04.13C07K16/10(2006.01)C12N15/70(2006.01)(62)分案原申请数据C07K16/00(2006.01)202110392556.X2021.04.13(71)申请人石河子大学地址832000新疆维吾尔自治区石河子市北四路221号石河子大学申请人新疆方牧生物科技有限公司(72)发明人盛金良杨艳陈创夫肖盛中李岩周子恒李玉豪宋雯妍郑婷(74)专利代理机构乌鲁木齐恒智专利商标代理事务所(普通合伙)65102专利代理师李靖权利要求书1页说明书8页序列表（电子公布）附图27页(54)发明名称能蛋白的反应原性。牛病毒性腹泻病毒纳米抗体及其制备方法及应用(57)摘要本发明属于生物技术检测领域，公开了一种抗BVDV‑重要功能蛋白纳米抗体及其制备方法和应用，主要通过构建BVDV‑NS5A表达载体，纯化NS5A蛋白；使用BVDV灭活苗对羊驼进行免疫，分离羊驼外周血淋巴细胞，通过巢式PCR获得VHH基因，构纳米抗体噬菌体展示文库，目的基因插入率为90.8％，文库容量为1.02×107CFU/mL，经M13K07噬菌体救援建立纳米抗体噬菌体展示文库容量为1.68×1016CFU/mL；以BVDV‑重要功能蛋白作为目标抗原，对扩繁得到的噬菌体展示文库进行三轮亲和筛选，从该文库筛选出与E0/E2/NS5A/NS3蛋白特异性结合纳米抗体，通过ELISA检测其反应原性，特异性良好的纳米抗体进行测序，分析序列，进而获得该特异性纳米抗体的基因，构建原核表达载体，对其进行原核表达、纯化和鉴定，得到所需纳米抗体Nb‑Y1、Nb‑Y2、Nb‑Y3，CN116023479A并通过Westernblot验证纳米抗体和BVDV重要功CN116023479A权利要求书1/1页1.一种抗BVDVE0的纳米抗体，其特征在于：氨基酸序列为SEQIDNO.2。2CN116023479A说明书1/8页牛病毒性腹泻病毒纳米抗体及其制备方法及应用技术领域[0001]本发明属于生物技术检测领域，具体涉及抗BVDV重要功能蛋白蛋白纳米抗体的制备方法与应用，首先表达并纯化获得BVDV‑NS5A蛋白，使用BVDV灭活苗对羊驼进行免疫，分离淋巴细胞及血清，通过构纳米抗体噬菌体展示文库，使用BVDV‑E0、E2、NS5A、NS3四种功能蛋白筛选特异性纳米抗体，ELISA检测其反应原性，并对特异性良好的纳米抗体进行表达和纯化，运用Wb验证纳米抗体的特异性。背景技术[0002]牛病毒性腹泻/粘膜病(BovineViralDiarrhea‑mucosaldisease,BVD‑MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)引起的传染病。各种年龄的牛都易感染、以犊牛易感性最高。传染源主要是病畜的分泌物、排泄物、血液和脾脏等，传播方式为直接接触或间接接触方式两种。患牛表现为发病急，体温突然升高至40～42℃，食欲废绝，消化道粘膜损伤严重，最初常表现为水样腹泻，后期粪便中带血和粘膜，死亡率可高达90％。因此BVD‑MD是养牛业中具有重大经济意义的疾病之一，也是进口检疫中应重点防范的疾病之一。据文献报道该病呈世界性分布，目前中国地区已有新疆、内蒙古、宁夏、山东、四川等20多个省市自治区不同程度的流行。[0003]BVDV属于黄病毒科瘟病毒属的单股正链RNA病毒，呈圆形有囊膜，与猪瘟病毒和羊边界病毒为同属病毒。BVDV主要有四个结构蛋白，衣壳蛋白(C)，囊膜蛋白(Erns，E1和E2)和7个非结构蛋白(P7，NS2/NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)。[0004]1993年，Hamers等在骆驼体内发现存在一种天然缺失轻链的抗体，称为纳米抗体(nanobody，Nb)。纳米抗体分子大小仅为15kDa、单链可变片段(30kDa)、Fab片段(60kDa)和完整抗体(150kDa)。尽管可以根据CDR2长度以及CDR1或framework‑2中另一个半胱氨酸的位置在单峰骆驼中区分不同的亚家族，但所有纳米抗体都属于同一序列家族，与III族人类VH3的家族家族密切相关；并且这种抗体仅有重链的可变区，有水溶性好、耐高温、易在原核系统中表达、组织穿透性强、高稳定性、甚至可口服吸收而不被降解、抗原结合高亲合性等优势都说明纳米抗体是理想的研究工具，可用于开发复杂的纳米生物技术；本试验接种羊驼后，可以将VHH基因克隆到噬菌粒载体中，然后可以通过针对抗原的噬菌体展示选择抗原特异性VHH。由于其体积小、自然可溶的特性，以及独特的靶向替代表位的