蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107462713A(43)申请公布日2017.12.12(21)申请号201710540740.8(22)申请日2017.07.05(71)申请人浙江大学地址310058浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号(72)发明人沈立荣张一帆辛晓璇蒋晨旻王一然(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200代理人林松海(51)Int.Cl.G01N33/558(2006.01)G01N33/543(2006.01)权利要求书1页说明书10页附图1页(54)发明名称蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用(57)摘要本发明公开了一种蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用。制备方法包括（1）能够特异性识别MRJP1蛋白的多克隆抗体SP-1和SP-2的制备和纯化；（2）胶体金溶液的制备；（3）硝酸纤维素膜上包被质控线（C线）和检测线（T线）；（4）以蜜蜂内源性蛋白MRJP1为标志物的蜂蜜双抗体夹心快速检测试纸条的组装；（5）蜂蜜检测样品的准备。从蜂蜜样品中分离纯化的蛋白与该金标试纸条反应后，根据T线是否显色可以判别蜂蜜样品的真伪。本发明的蜂蜜双抗体金标试纸条适用于人造糖浆冒充的假蜂蜜的检测，为蜂蜜质量及掺假检测提供了一种非常可靠的快速检测新方法。CN107462713ACN107462713A权利要求书1/1页1.一种蜂蜜快速检测试纸条的制备方法，其特征在于，步骤如下：1）针对MRJP1的多克隆抗体SP-1和SP-2的制备和纯化：1.1通过对MRJPs蛋白家族氨基酸序列作同源性分析，筛选出MRJP1不同于其他家族成员的氨基酸序列：分别位于MRJP1第56-70位的寡肽1-SGEYDYKNNYPSDID，第360-372位的寡肽2-IKEALPHVPIFD，即分别为抗体SP-1和SP-2所对应的抗原多肽；1.2根据寡肽1和寡肽2的氨基酸序列，进行化学合成，将多肽与KLH偶联，作为免疫抗原；1.3分别将2个免疫抗原与缓冲液和佐剂混合，在第1d、15d、29d、43d分别多点注射新西兰大白兔2只；1.4第53d，颈动脉取血，收集血清，通过抗原亲和柱纯化、透析，分别得到MRJP1的特异性抗体SP1和SP2；2）胶体金溶液的制备：取氯金酸水溶液制备成含有粒径为20-40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液；3）胶体金标记抗体：取SP-1抗体加入到胶体金溶液中，制备成免疫胶体金溶；4）在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被商用羊抗兔lgG，T线为检测线，包被上述步骤1）制得的SP-2抗体；用划膜机点在硝酸纤维素膜上即得C线和T线，使C线和T线相距5mm；室温晾干，得到包被后的硝酸纤维素膜；5）胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装：将样品垫、上述步骤4）所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水垫一次粘贴到聚氯乙烯（PVC）底板上，切割成2~3mm宽的条状，即得快速检测试纸条；4℃避光干燥保存。2.一种如权利要求1所述的制备方法得到的蜂蜜快速检测试纸条。3.一种如权利要求2所述的蜂蜜快速检测试纸条的应用，其特征在于，包括以下步骤：（a）蜂蜜样品检测液的准备：将蜂蜜样品用纯水以质量比1：1稀释，混匀，4℃抽提过夜；将抽提液离心，12000rpm，离心30min，取上清，得蜂蜜样品水提液；将蜂蜜样品水提液移入透析袋，在去离子水中透析过夜，得到蜂蜜透析液；（b）用移液枪吸取步骤（a）所得待检样品溶液80-100μL，滴加于96孔酶标板内；（c）将金标试纸条从干燥器中取出，于试纸条样品垫上点加金标抗体浓缩液8μL；将试纸条样品垫一端插入待检样品溶液中；（d）在插入试纸条5-10min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直至于观察者正面；（e）结果判断：C线显示为红色线条，当T线显色，结果为阳性，待测样品中含有MRJP1；当T线不显色，结果为阴性，待测样品中不含MRJP1：即所测蜂蜜为掺假蜂蜜；C线不显示的为红色线条，结果无效。2CN107462713A说明书1/10页蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用技术领域[0001]本发明涉及一种蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用。背景技术[0002]蜂蜜是蜜蜂釆集植物的花蜜、分泌物或蜜露与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。作为营养丰富的天然甜味剂和保健品，蜂蜜深受全球消费喜爱，但它却是一种极易被掺假的食品。近些年来蜂蜜掺假愈演愈烈，掺假越来越不容易被识别，已严重扰乱蜂蜜市场秩序。中国蜂产品协会公布的2014年网售蜂蜜抽检结果显示，在淘宝、天猫和京东商城销量领先的20款蜂蜜中，有13款产品掺假，导致产品信任危机，行业整体价格和效益下降，对蜂蜜产业的健康发展造成严重影响。以前蜂蜜掺假的主要方式是