一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103293317A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103293317103293317A(43)申请公布日2013.09.11(21)申请号201310158383.0(22)申请日2013.04.28(71)申请人浙江省疾病预防控制中心地址310051浙江省杭州市滨江区滨盛路3399号(72)发明人任一平赖世云张京顺(74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司33201代理人黄美娟冷红梅(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)C12Q1/37(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书8页说明书8页序列表1页序列表1页附图7页附图7页(54)发明名称一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒及其应用(57)摘要本发明提供了一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒，主要包括牛乳β-乳球蛋白特异肽（氨基酸序列为：TPEVDDEALEK）、同位素标记牛乳β-乳球蛋白特异肽（氨基酸序列为：TPEV*DDEAL*EK，其中V*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸）和同位素标记牛乳β-乳球蛋白内标物（氨基酸序列为：CQCLVRTPEV*DDEAAL*EKFDKALKA，其中V*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸）；本试剂盒的定量限：0.004g/100g，重现性：RSD<6.2%，n=11天，回收率：93.6～99.8%（n=6），试样预处理简单，快速，成本低，并可同时对各类试样中非变性和热变性的牛乳β-乳球蛋白进行准确定量。CN103293317ACN103297ACN103293317A权利要求书1/1页1.一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒，主要包括牛乳β-乳球蛋白特异肽、同位素标记牛乳β-乳球蛋白特异肽和同位素标记牛乳β-乳球蛋白内标物，所述牛乳β-乳球蛋白特异肽的氨基酸序列为：TPEVDDEALEK；所述同位素标记牛乳β-乳球蛋白特异肽的氨基酸序列为：TPEV*DDEAL*EK，其中V*和L*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛乳β-乳球蛋白内标物的氨基酸序列为：CQCLVRTPEV*DDEAAL*EKFDKALKA，其中V＊和L＊为碳氮全同位素标记的氨基酸。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括：NH4HCO3溶液，DTT溶液，IAA溶液，CaCl2溶液，胰蛋白酶溶液，甲酸。3.如权利要求1所述的试剂盒在定量检测乳或乳制品中牛乳β-乳球蛋白含量中的应用。2CN103293317A说明书1/8页一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒及其应用（一）技术领域[0001]本发明涉及一种可测定乳或乳制品中热变性和非变性的常量或微量的牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒及其应用。（二）背景技术[0002]牛乳是FAO/WHO认定的导致人类食物过敏的八大类食品之一，是导致儿童食物过敏的常见食物，它在儿童中的发病率为0.1～7.5%，严重危害婴幼儿健康。而其中的牛乳β-乳球蛋白被认为是主要的过敏原。[0003]牛乳β-乳球蛋白（Bovineβ-lactglobulin，β-LG）是牛奶当中蛋白质的一种，约占鲜奶蛋白质的7-12%。在细胞及动物实验研究中发现，β-乳球蛋白的水解物或分子修饰物，具有降胆固醇与抗氧化等生理活性。前人研究发现牛乳β-乳球蛋白存在多种形式的遗传变异体，其中最主要的为变异体A（β-LGA）和B（β-LGB），它们之间的区别在于氨基酸序列中第64和118处两个氨基酸残基的不同（A中的ASP64和Val118分别改变为B中的Gly64和Ala118），而人乳则完全不含β-乳球蛋白。[0004]牛乳β-乳球蛋白是由162个氨基酸残基组成的结构紧密的单体球蛋白，每个单体含有两个二硫键Cys66-Cys160和Cys106-Cys199，还有一个Cys121自由巯基。结构相对稳定，遗传变异体β-LGA的平均分子量为18363Da，遗传变异体β-LGB的平均分子量为18277Da,牛乳β-乳球蛋白平均分子量为18320Da。由于原料质量混杂、加工工艺不同等原因造成产品质量良莠不齐，但又没有用于监测乳与乳制品中β-乳球蛋白（包括β-LGA和β-LGB）的准确有效的定量检测方法，其中主要原因是缺少用于准确定量测定的方法和必要的实验材料。[0005]目前国内外用于牛乳β-乳球蛋白的检测方法仍以SDS-PAGE法为主，该法为半定量方法，不能进行准确定量，由于操作繁琐无法在普通的实验室进行推广；有人提出了应用GPC-UV的检测方法，由于凝胶色谱柱的分辨力低，紫外光检测灵敏度低的原因，而不能用于复杂基质或低含量的样品检测；ChristophCzerwenka（2007）等人采用LC-MS联用方法测定牛奶和乳制品中牛乳β-牛乳球蛋白的含量，在