一种生乳中乳蛋白定量检测试剂盒及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115754114A(43)申请公布日2023.03.07(21)申请号202211439356.6(22)申请日2022.11.17(71)申请人上海市农产品质量安全中心地址201708上海市青浦区华新镇新府中路1528弄28号(72)发明人韩奕奕丰东升张维谊马颖清蒋栋华陈柔含杨晓君刘洋王霞朱春燕邓波王敏杨静周彬(74)专利代理机构上海泰博知识产权代理有限公司31451专利代理师谢文凯(51)Int.Cl.G01N30/88(2006.01)G01N30/06(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图4页(54)发明名称一种生乳中乳蛋白定量检测试剂盒及其应用(57)摘要本发明涉及一种生乳中乳蛋白定量检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘代乙酰胺、牛胰蛋白酶、甲酸。本发明实现了同时测定生乳中乳铁蛋白、α‑乳白蛋白和β‑乳球蛋白含量，方法操作简单、快速、准确度和灵敏度高，可以做到批量测定，具有良好的实际应用前景。CN115754114ACN115754114A权利要求书1/2页1.一种生乳的前处理试剂，其特征在于，所述试剂包括：提取剂、还原剂、烷基化试剂、酶试剂、终止剂；其中所述提取剂为碳酸氢铵；还原剂为二硫苏糖醇；烷基化试剂为碘代乙酰胺；酶试剂为牛胰蛋白酶；终止剂为甲酸。2.根据权利要求1所述前处理试剂，其特征在于，所述提取剂为80～120mmol/L碳酸氢铵溶液；还原剂为450～550mmol/L二硫苏糖醇溶液；烷基化试剂为450～550mmol/L碘代乙酰胺溶液；酶试剂为80～120μg/mL牛胰蛋白酶溶液。3.一种生乳中乳蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含权利要求1所述试剂。4.一种生乳中乳蛋白定量检测方法，包括：(1)称取生乳样品，水稀释，涡旋摇匀，得到稀释样品；(2)取稀释样品并加入提取剂，混匀，加入还原剂，混匀，于60℃恒温水浴50～60min；冷却至室温，加入烷基化试剂，暗处静置30～40min，加入酶试剂，混匀后置于35～39℃恒温水浴酶解过夜，最后加入终止剂终止反应，静置，用水定容，离心，取上清液，得到样品溶液，然后进行高效液相色谱‑串联质谱检测；(3)根据乳蛋白基质混合标准工作溶液进行高效液相色谱‑串联质谱检测，并以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线；(4)将样品溶液中乳蛋白的色谱峰面积代入到标准工作曲线中，计算得到乳蛋白的含量。5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中稀释样品的浓度为4～5％；所述提取剂与稀释样品的体积比为0.7～0.8；还原剂与稀释样品的体积比为0.07～0.08；烷基化试剂与稀释样品的体积比为0.12～0.18；酶试剂与稀释样品的体积比为0.2～0.3；终止剂与稀释样品的体积比为0.04～0.06。6.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，所述步骤(2)、(3)中高效液相色谱‑串联质谱参数均为：液相色谱条件：色谱柱：C8柱；进样体积：10μL；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；流动相为流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱梯度程序：0～0.5min，5％B；0.5～4.5min，70％B；4.5～5.5min，70％B；5.5～6.0min，5％B；6.0～8.0min，5％B；质谱条件：离子源：电喷雾离子源；电离模式：正离子扫描；监测模式：多重反应监测MRM；干燥气温度200℃；干燥气流量14L/min；雾化气压力20psi；鞘气温度300℃；鞘气流量11L/min；毛细管电压4.00kV；喷嘴电压300V。7.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中高效液相色谱‑串联质谱检测的目标物是乳铁蛋白、α‑乳白蛋白、β‑乳球蛋白中经牛胰蛋白酶酶解后的特征性肽段，其氨基酸序列分别为：乳铁蛋白：SFQLFGSPPGQR、α‑乳白蛋白：VGINYWLAHK和β‑乳球蛋白：TPEVDDEALEK。8.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中基质混合标准工作溶液具体为：将马乳基质中添加乳铁蛋白、α‑乳白蛋白和β‑乳球蛋白标准溶液，按样品前处理过程，进行提取，还原，烷基化，酶切处理，最终得到基质混合标准工作溶液。9.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中乳蛋白为乳铁蛋白、α‑乳白蛋白、β‑乳球蛋白中的一种或几种；所述标准工作曲线为：2CN115754114A权利要求书2/2页乳铁蛋白的标准工作曲线：y＝53747.51702x‑21822.47985，R2＝0.99922；α‑乳白蛋白的标准工作曲线：y＝48652.34122x‑9525.06444，R2＝0.99973；β‑乳球蛋