纯白蛋白及其制备和检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103608351103608351A(43)申请公布日2014.02.26(21)申请号201280022116.4(74)专利代理机构北京英赛嘉华知识产权代理(22)申请日2012.05.06有限责任公司11204代理人王达佐安佳宁(30)优先权数据3947842011.05.06PL(51)Int.Cl.C07K1/14(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C07K14/765(2006.01)2013.11.06(86)PCT国际申请的申请数据PCT/IB2012/0008872012.05.06(87)PCT国际申请的公布数据WO2013/050830EN2013.04.11(71)申请人EIT+弗罗茨瓦夫研究中心有限公司地址波兰弗罗茨瓦夫省(72)发明人雅德维加·彼特凯维奇阿尼斯卡·希德尔阔卡塔尔兹那·杰日巴里贾纳·达尼埃莱维克兹马格达琳娜·斯坦尼谢夫斯卡阿尔卡杜伊斯·巴尔蒂斯安杰伊·加米安权权利要求书1页利要求书1页说明书7页说明书7页附图3页附图3页(54)发明名称纯白蛋白及其制备和检测方法(57)摘要本发明的主题在于纯的单体牛血清白蛋白、特征为在树脂中使用柱色谱法的制备该纯的单体牛血清白蛋白的方法以及使用动态光散射鉴定该纯的单体牛血清白蛋白的方法。CN103608351ACN103685ACN103608351A权利要求书1/1页1.在12%分离凝胶中通过SDS/PAGE用电泳测定的分析纯的单体牛血清白蛋白。2.如权利要求1所述的分析纯的单体牛血清白蛋白，其特征在于BSA分子的直径基本为7nm。3.获得单体血清白蛋白的方法，其特征在于所述方法包括：a)BSA制剂的样品的制备；b)使用平衡缓冲剂在用缓冲剂平衡的树脂上进行的阶段a)中获得的样品的纯化色谱法，所述树脂优选为HW55，所述缓冲剂优选为0.1M的pH5.65的含1%正丁醇的乙酸盐缓冲液。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于阶段a)包括除去疏水性配体，优选地将所述样品通过炭来除去所述疏水性配体。5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于在阶段b)中的所述纯化在室温下以1.2ml/10min的速率实施。6.鉴定白蛋白的方法，其特征在于所述方法包括使用动态光散射测定在使用权利要求1所述的方法获得的级份中蛋白分子的直径，其中携带单体BSA的级份为具有直径基本为7nm的分子的级份。2CN103608351A说明书1/7页纯白蛋白及其制备和检测方法[0001]牛血清白蛋白(BSA)是最便宜的可商购的蛋白之一。其在纯理论研究[1-4]和大量实际使用[5-18]中广泛用作模型蛋白。得自BSA水解的游离氨基酸的混合物通常用于测定蛋白的氨基酸含量。用于该目的的商品BSA是足够纯的，尽管存在被糖污染的可能性。由于水解，污染物被降解且不妨碍氨基酸分析。白蛋白是循环系统中脂肪酸和其它疏水性物质的转运体。由此，在将BSA用于研究之前，有必要使用炭除去疏水性污染物。BSA用于检测GFP(绿色荧光蛋白)，促进被评估的细胞的超灵敏成像[6]。与量子点结合的修饰的BSA表面已经用于金属离子的分析检测[7]。因为该蛋白已成为光动力学疗法中光敏剂的有效载体，所以其可以用作炎症和肿瘤的治疗中有效成分的转运体[9-12]。此外，作为小分子的载体，BSA增加了所附着的化合物的免疫原性，这可能获得用于在ELISA测试中检测小分子的高灵敏性和特异性抗体[13,14]。BSA还用于构建结合疫苗。在与多糖抗原结合之后，可以获得抗病原体的有效且安全的疫苗。在类似的系统中，BSA还用于肿瘤治疗[15-18]。在这样的用途中，BSA应具有高纯度。特别地，其应没有糖污染。早期的报道指出在BSA制剂中存在高分子量衍生物[19]。可以形成高度聚合的聚集体，这是因为蛋白与反应性羰基化合物通过糖化而反应[20-23]。由于在蛋白环境中存在还原性糖，因此形成这样的污染聚集体可能存在风险。一系列报道表明在干燥条件下在热修饰期间以及在干粉制剂中，蛋白被果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖和葡聚糖糖化[24-27]。Fischer等人分析了各种治疗性单克隆抗体在其储存期间在含有具有糖组分的缓冲剂的制剂中以及在这些蛋白与葡聚糖在输液袋(通常用于给予治疗性蛋白的临床实践中)中进行短期孵育之后的糖化产物[28]。已经观察到商品BSA的自然糖化[19]。白蛋白易于在体内被糖化为大部分常见的血清蛋白[29,30]。在干燥条件下在高温合成期间，在BSA与己醛糖的反应期间也已经观察到聚集[31]。在BSA与葡萄糖和果糖一起孵育之后，已检测到高度糖化产物[25,29,31,32]。糖污染的商品BSA制剂的GLC-MS分析已经显示aldit