用于猪瘟病毒检测的重组蛋白及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103694356103694356A(43)申请公布日2014.04.02(21)申请号201310739413.7(22)申请日2013.12.27(71)申请人广西壮族自治区兽医研究所地址530001广西壮族自治区南宁市友爱北路51号(72)发明人吴健敏覃绍敏刘金凤李作生韦建兴马玲白安斌陈凤莲饶桂波(74)专利代理机构广西南宁公平专利事务所有限责任公司45104代理人杨立华(51)Int.Cl.C07K16/46(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12N15/70(2006.01)G01N33/569(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书7页说明书7页序列表14页序列表14页(54)发明名称用于猪瘟病毒检测的重组蛋白及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种用于猪瘟病毒检测的重组蛋白，由抗人红细胞表面H抗原单链抗体基因和抗猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白单链抗体基因拼接而成的融合基因所编码。该重组蛋白具有双功能特性，它既能够与人红细胞结合但不会发生凝集，又能够与猪瘟病毒结合，在病毒桥联作用下发生肉眼可观察到的凝集现象。本发明获得的重组蛋白可用于猪瘟病毒的检测，操作简单、灵敏度高且特异性强，满足了基层现场使用快速、简便的要求。CN103694356ACN1036945ACN103694356A权利要求书1/1页1.一种用于猪瘟病毒检测的重组蛋白，其特征在于由抗人红细胞表面H抗原单链抗体基因和抗猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白单链抗体基因拼接而成的融合基因所编码。2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：所述融合基因具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。3.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述重组蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：<1>分别从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体和抗猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA作为RT-PCR反应的模板，扩增出重链可变区基因和轻链可变区基因；<2>采用SOE-PCR方法将步骤<1>获得的两组重链可变区基因和轻链可变区基因分别拼接成单链抗体基因；<3>将步骤<2>获得的两个单链抗体基因通过SOE-PCR方法拼接成融合基因；<4>将步骤<3>获得的融合基因插入到原核表达载体中构建重组质粒，转化入大肠杆菌表达菌株，在IPTG的诱导下表达出重组蛋白。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤<2>中的单链抗体基因是在重链可变区基因和轻链可变区基因之间插入一段Linker连接序列而得，Linker连接序列具有序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤<3>中的两个单链抗体基因分别具有序列表SEQ.ID.No.4和SEQ.ID.No.5的碱基序列，融合基因具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于还包括以下步骤：<5>将步骤<4>获得的重组蛋白经纯化、复性后得具有生物学活性的重组蛋白。8.权利要求1所述重组蛋白在制备检测猪瘟病毒试剂方面的应用。2CN103694356A说明书1/7页用于猪瘟病毒检测的重组蛋白及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于重组蛋白技术领域，尤其涉及一种用于猪瘟病毒检测的重组蛋白及其制备方法和应用。背景技术[0002]猪瘟（ClassicalSwineFever,CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种严重危害全球养猪业的高度接触性传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类传染病，也是我国计划要消灭的重大动物疫病之一。猪瘟等动物疫病一直是阻碍我国养猪业健康发展的重要因素，每年造成的直接经济损失达百亿元，因猪瘟的存在影响生猪及其产品出口造成的经济损失更是无法估量。[0003]及时、准确的对CSFV进行检测，是诊断、预防和控制CSF的前提。目前CSFV的检测技术包括易感动物攻毒试验、兔体交互免疫试验、ELISA抗原捕获法、免疫荧光试验、反转录-聚合酶链反应、实时荧光定量反转录-聚合酶链反应、核酸探针技术和基因芯片技术等，但是这些检测方法要求较高，需要配备专门的仪器和专业技术人员，检测成本昂贵，而且耗时相对较长，这极大地限制了其在基层单位的应用。我国仍然以农村中小规模猪场为主体，这些猪场由于受经济、技术条件的限制，无法建立自己的检测实验室，因此急需建立一种快速、简便、成本低，不需要特殊仪器设备，适合基层和现场使用的CSFV检测试剂和方法。发明内容[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种用于猪瘟病毒检测的重组蛋白及其制备方法和应用，以便于实现基层现场