一种检测布鲁氏菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103602721103602721A(43)申请公布日2014.02.26(21)申请号201310298369.0(22)申请日2013.07.16(71)申请人黄耀江地址100081北京市海淀区民族大学西路60号2号楼0604室(72)发明人黄耀江蒋丹杨志达靳卫林闫强(74)专利代理机构北京三聚阳光知识产权代理有限公司11250代理人彭秀丽(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12Q1/04(2006.01)权利要求书2页权利要求书2页说明书12页说明书12页C12R1/01(2006.01)序列表2页序列表2页附图7页附图7页(54)发明名称一种检测布鲁氏菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒(57)摘要本发明涉及一种检测布鲁氏菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒。本发明所述的LAMP引物包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，以及2对环引物（LF1和LB1，或者LF2和LB2）；所述试剂盒包括所述LAMP引物、BstDNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液等。本发明利用环介导等温扩增反应（LAMP），由Bstploymerase和所述LAMP引物对靶基因BCSP31进行特异性扩增，可以快速、准确、方便地检测出人血样或者牛奶中的布鲁氏菌。本发明所述的检测方法灵敏度较高，检测下限可达到35fg，反应时间短，不需要昂贵的仪器来实现，可操作性强；并且产物检测方便，通过肉眼观察或染色法就能实现，具有很高的实用价值。CN103602721ACN103627ACN103602721A权利要求书1/2页1.一种用于检测布鲁氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的正向内引物FIP、核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的反向内引物BIP、核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的正向外引物F3以及核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的反向外引物B3。2.根据权利要求1所述的用于检测布鲁氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物还包括核苷酸序列分别如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的环引物LF1和LB1，或者核苷酸序列分别如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的环引物LF2和LB2。3.一种用于检测布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的LAMP引物、BstDNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水;其中，所述含dNTPs的反应缓冲液包含40mMpH8.8的Tris-HCl、20mMKCl、20mM(NH4)2SO4、16mMMgSO4、0.2%吐温20、1.6M甜菜碱以及2.8mMdNTPs。4.根据权利要求3所述的用于检测布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括40pM/μL引物FIP100μL，40pM/μL引物BIP100μL，5pM/μL引物F3100μL，5pM/μL引物B3100μL，20pM/μL引物LF1或LF2100μL，20pM/μL引物LB1或LB2100μL，8U/μL的BstDNA聚合酶100μL，含dNTPs的反应缓冲液1.5mL，去离子水1mL。5.一种检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：S01：制备模板DNA；S02：以S01中所得的DNA作为模板，采用权利要求1或2所述的LAMP引物，于60℃～65℃进行LAMP扩增反应，反应时间为55min～90min；所述LAMP扩增反应的体系为25μL，各组分的含量如下：或者2CN103602721A权利要求书2/2页S03:扩增结果判定。6.根据权利要求5所述的检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，所述步骤S02中，利用Real-timeturbidimeter浊度仪进行LAMP扩增反应；通过浊度仪连接的LA-320程序显示的浊度上升时间鉴定所述步骤S02中特异性扩增产物的存在。7.根据权利要求5或6所述的检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，所述步骤S02中，所述LAMP扩增反应的温度为63℃，时间为90min。8.根据权利要求5-7任一所述的检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，所述布鲁氏菌为人体血液或者牛奶中的布鲁氏菌。9.一种利用权利要求3或4所述的试剂盒在检测布鲁氏菌中的应用。10.一种利用权利要求1或2所述的LAMP引物在检测布鲁氏菌中的应用。3CN103602721A说明书1/12页一种检测布鲁氏菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒技术领域[0001]本发明涉及一种快速检测布鲁氏菌的方法以及LAMP引物及包含该引物的试剂盒，属于微生物检测技术领域。背景技术[0002]布鲁氏菌（Brucellaspp.）是一种革兰氏阴性