检测荷花腐败病菌的LAMP引物组、试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106086211A(43)申请公布日2016.11.09(21)申请号201610634617.8(22)申请日2016.08.04(71)申请人东莞市香蕉蔬菜研究所地址523061广东省东莞市万江区新和基业路3号申请人东莞市农业科学研究中心(72)发明人曾莉莎吕顺郑芝波麦进培周建坤胡规媛(74)专利代理机构广州三环专利代理有限公司44202代理人张艳美郝传鑫(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图2页(54)发明名称检测荷花腐败病菌的LAMP引物组、试剂盒及检测方法(57)摘要本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种快速检测荷花腐败病菌的LAMP引物组、试剂盒及其检测方法。本发明针对荷花腐败病菌翻译延伸因子(TEF-1α)基因序列设计得到一组引物组F3/B3和FIP/BIP，由该引物组或含有该引物组的试剂盒通过环介导等温扩增(LAMP)检测荷花腐败病菌，具有成本低、易操作、简单、快速、检测结果直观、肉眼可判断、灵敏度高、特异性强等优点，本发明适用于基层部门荷花(莲藕)引种检疫、种苗种藕质量检测及荷花腐败病菌田间早期诊断等，具有广泛和实际的应用价值。CN106086211ACN106086211A权利要求书1/1页1.一种用于检测荷花腐败病菌的LAMP引物组，其特征在于，所述引物组包含一对外引物对F3/B3和一对内引物对FIP/BIP，引物序列如下：F3：5’-TTCCACAACCTCAATGAGC-3’B3：5’-TGTCAGTACGAAGAGAAGTAGA-3’FIP：5’-CCAGGCGTACTTGAAGGAACCGTCAAGCAGTCACTAACCAT-3’BIP：5’-AGCGTGAGCGTGGTATCACCCAATGACGGTGACATAGTAG-3’。2.一种用于检测荷花腐败病菌的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述LAMP引物组。3.根据权利要求2所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有基因组DNA提取液、LAMP反应液、阳性对照品、阴性对照品、稳定液和显色液；所述LAMP反应液除含有权利要求1所述引物组外还含有BstDNA聚合酶和反应缓冲液。4.根据权利要求3所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述基因组DNA提取液为CTAB提取液。5.根据权利要求3所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液的最终浓度为1.3～1.5mmol/LdNTPs、0.6～0.9mmol/L甜菜碱和7～9mmol/LMgSO4。6.根据权利要求3所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为荷花腐败病菌基因组DNA；所述阴性对照品为无菌水。7.根据权利要求3所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述稳定液为石蜡油；所述显色液为稀释1000倍的SYBRGreenI。8.根据权利要求3所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：基因组DNA2.0μL，8U/μL的BstDNA聚合酶1.0μL，反应缓冲液12.5μL，0.2μmol/L的F3/B3引物各1.0μL，1.6μmol/L的FIP/BIP引物各1μL，用超纯水补齐到25μl。9.利用权利要求1所述LAMP引物组或权利要求2至8任一项所述试剂盒检测荷花腐败病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.基因组DNA提取：如果检测样本为荷花腐败病菌菌丝体或带病的荷花植株组织，则利用CTAB法抽提荷花腐败病菌或荷花植株组织中的病原菌的DNA；如果检测样本为土壤，则使用土壤基因组DNA快速提取试剂盒提取疑感染土壤的微生物总DNA；S2.配制反应体系：在所述反应体系中加入稳定液，在反应管管盖上加入显色液；所述稳定液的加入量为20～25μL，显色液的加入量为1.5～2μL；S3.环介导等温扩增：以基因组总DNA为模板，利用所述引物组经扩增得到扩增产物；所述引物组包含一对外引物对F3/B3和一对内引物对FIP/BIP，所述扩增反应的程序为63～65℃1h，80～82℃5min，4℃保存；S4.扩增产物检测：扩增反应完毕，将反应管管盖上的显色液与扩增产物震荡混匀，利用显色法对扩增产物进行分析，观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有荷花腐败病菌；反应产物变为橙色，则不含有荷花腐败病菌。2CN106086211A说明书1/6页检测荷花腐败病菌的LAMP引物组、试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测荷花腐败病菌的LAMP引物组、试剂盒及其检测方法。背景技术[0002]荷花是重要的经济植物，其地下茎—藕、莲子，历来