用于检测狂犬病病毒的LAMP引物及其试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103361445A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103361445103361445A(43)申请公布日2013.10.23(21)申请号201310324354.7(22)申请日2013.07.30(71)申请人广西壮族自治区兽医研究所地址530001广西壮族自治区南宁市友爱北路51号(72)发明人潘艳李军杨威陈泽祥彭昊许力干马春霞胡帅禤雄标柳峰谢永平(74)专利代理机构广西南宁公平专利事务所有限责任公司45104代理人杨立华(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书4页说明书4页序列表3页序列表3页附图2页附图2页(54)发明名称用于检测狂犬病病毒的LAMP引物及其试剂盒(57)摘要本发明公开了用于检测狂犬病病毒的LAMP引物，采用环介导等温扩增（LAMP）技术，并根据狂犬病病毒ERA株的L基因设计了两个特异性外引物F3和B3、两个特异性内引物FIP和BIP和一个特异性环引物LF，由此发明了用于检测狂犬病病毒的LAMP试剂盒。应用本发明的LAMP试剂盒建立狂犬病病毒检测方法，仅需通过对组织样品进行RNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出狂犬病病毒，方便基层快速、准确、简便地进行狂犬病诊治，具有特异性强、灵敏度高、迅速得出结果、不造成污染等优点。CN103361445ACN103645ACN103361445A权利要求书1/1页1.用于检测狂犬病病毒的LAMP引物，其特征在于包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LF，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.5的碱基序列。2.一种用于检测狂犬病病毒的LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：反应缓冲液、酶溶液、去离子水、荧光目视检测试剂及狂犬病病毒模板，反应缓冲液中含有LAMP引物，LAMP引物包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LF，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.5的碱基序列。3.根据权利要求2所述的用于检测狂犬病病毒的LAMP试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液为2×反应缓冲液，12.5μl反应缓冲液中含有外引物F3和B3各5pmol、内引物FIP和BIP各40pmol及环引物LF20pmol。4.根据权利要求2所述的用于检测狂犬病病毒的LAMP试剂盒，其特征在于：所述荧光目视检测试剂为钙黄绿素荧光染料。2CN103361445A说明书1/4页用于检测狂犬病病毒的LAMP引物及其试剂盒技术领域[0001]本发明涉及狂犬病病毒检测技术领域，尤其涉及用于检测狂犬病病毒的LAMP引物及其试剂盒。背景技术[0002]狂犬病（rabies）是由狂犬病病毒（rabiesvirus,RV）引起的人畜共患传染病，它可以感染所有的温血动物，一旦发病100%死亡。过去几十年来，尽管疫苗研究以及狂犬病的防治工作已经取得了很大进展，但全世界范围内每年因狂犬病而死亡的病例仍达到4000-70000例。非洲和亚洲是狂犬病流行的主要区域，在该地区狗是病毒最主要的宿主，也是引起人死亡的主要原因。狂犬病也是我国的主要公共卫生问题，近年来我国狂犬病的发病和死亡人数位居全球第二，仅次于印度。据卫生部报道，过去60年间（1950-2010）我国因狂犬病而死亡的人共有124255人，平均每年死亡人数为2037人。[0003]目前，狂犬病病毒的检测方法有：荧光抗体试验(FluorescentAntibodyTest,FAT)、快速狂犬病酶免疫诊断法(RapidRabiesEnzymeImmunodetection,RREID)、小鼠颅内接种分离狂犬病毒法(Mouseinjectiontest,MIT)、细胞培养分离技术(CellcultureIsolationTechniques,CIT)、RT-PCR、荧光定量PCR等。其中，FAT需要荧光显微镜，且荧光阳性和阴性不易辨认，需要有经验的操作人员。MIT和CIT耗时很长，并需要配合FAT技术才能判定结果。RREID和胶体金免疫层析法简单、快速，但灵敏度不够，对于动物咽拭子等病毒含量较少的样品，检出率难以达到要求。殷相平等建立的RT-PCR技术在狂犬病的分子生物学诊断上应用得最多最普遍，其特点是敏度高、特异性强，适合于实验室应用，但需要特定仪器，耗时较长。由于诊断仪器设备的缺乏，基层防疫机构难以进行狂犬病病毒的检测。鉴于狂犬病的危害性，急需建立一种快速检测方法适用于临床诊断。[0004]Notomi等在2000年报道了一种新的DNA扩增技术—环介导等温扩增技术。该技术具有方法简单、快速、特