一种丁香疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108588265A(43)申请公布日2018.09.28(21)申请号201810599786.1(22)申请日2018.06.11(71)申请人南京林业大学地址210037江苏省南京市龙蟠路159号(72)发明人戴婷婷焦彬彬郑香荣李中言王明远(74)专利代理机构南京申云知识产权代理事务所(普通合伙)32274代理人邱兴天(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书1页说明书8页附图2页(54)发明名称一种丁香疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法(57)摘要本发明公开了一种丁香疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。该环介导等温扩增检测引物组合物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3组成。本发明的检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，同时还为检疫性疫霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于丁香疫霉的高灵敏度快速检测，同时在病害侵染初期鉴定出病原物，能够对出入境水果样品中的丁香疫霉进行检测。本发明对丁香疫霉引起的疫病和对减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。CN108588265ACN108588265A权利要求书1/1页1.一种用于检测丁香疫霉的环介导等温扩增引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3组成；各引物序列具体如下：FIP：5＇-GCCGCGGTAGTAGCTGCTAGT-TTGTAGTGGGACACGGCT-3′；BIP：5＇-CGTGGTGTACGACGTGACGG-CGACGCACCTATCAATCTCG-3＇；F3：5＇-CTGTAGAGCATGCTGCTGAT-3＇；B3：5＇-CCCGCAGAGAAACCTATGG-3＇。2.权利要求1所述的环介导等温扩增引物组合物在检测丁香疫霉中的应用。3.一种检测丁香疫霉的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含体积为一次用量以上的检测溶液，其中，1mL的检测溶液包括：48mMdNTPs、0.8MTris-HC、0.4mMKCl、0.4mM(NH4)2SO4、0.24mMMgSO4、4％TritonX-100、BstDNApolymerase320单位，200mM羟基萘酚蓝、32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3；其中，各引物序列具体如下：FIP：5′-GCCGCGGTAGTAGCTGCTAGT-TTGTAGTGGGACACGGCT-3＇；BIP：5＇-CGTGGTGTACGACGTGACGG-CGACGCACCTATCAATCTCG-3＇；F3：5＇-CTGTAGAGCATGCTGCTGAT-3＇；B3：5′-CCCGCAGAGAAACCTATGG-3＇。4.权利要求3所述的检测丁香疫霉的环介导等温扩增试剂盒在检测丁香疫霉中的应用。5.一种检测丁香疫霉的方法，其特征在于：提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的环介导等温扩增引物组合物或权利要求3所述的环介导等温扩增试剂盒进行环介导等温扩增；观察环介导等温扩增反应溶液颜色变化，天蓝色表示检测为阳性，存在丁香疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在丁香疫霉。6.根据权利要求5所述的检测丁香疫霉的方法，其特征在于：提取待检微生物的DNA，取2μLDNA溶液，加入23μL环介导等温扩增试剂盒中的检测溶液进行环介导等温扩增，环介导等温扩增反应程序为：64℃，60min，扩增产物进行颜色变化的观察。2CN108588265A说明书1/8页一种丁香疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丁香疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。背景技术[0002]丁香疫霉(Phytophthoraramorum)属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。该菌寄主分布范围广，主要分布于美国、日本、加拿大、英国、法国、德国、意大利、澳大利亚等国，在我国未有发生报道。该病菌主要通过被侵染病菌的幼成年苗、泥土和果实远距离传播。病菌主要侵染柑橘类水果、李属类水果、火棘、丁香、欧洲板栗、橡树等14个科