一种伏马毒素定向免疫磁珠及其制备方法和用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105842439A(43)申请公布日2016.08.10(21)申请号201510016965.4(22)申请日2015.01.14(71)申请人北京康诺生物科技有限公司地址102101北京市延庆县八达岭经济开发区康西路1629号(72)发明人张彦明柳家鹏(51)Int.Cl.G01N33/531(2006.01)G01N33/68(2006.01)G01N33/569(2006.01)G01N30/06(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表1页附图2页(54)发明名称一种伏马毒素定向免疫磁珠及其制备方法和用途(57)摘要本发明涉及一种伏马毒素定向免疫磁珠及其制备方法和用途。该定向免疫磁珠利用蛋白G或者蛋白A偶联到磁珠上，然后用抗伏马毒素的抗体与磁珠上的蛋白G或者蛋白A偶联。然后再利用交联剂对结合伏马毒素抗体的蛋白G/蛋白A磁珠进行交联。该免疫制备方法充分利用了蛋白G与蛋白A与抗体亲和力高以及与抗体的Fc片段特异性结合的特点。主要用于对于粮食、食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的伏马毒素的结合和纯化。可以用于伏马毒素检测前样品前期处理，样品中伏马毒素检测以及伏马毒素纯化。CN105842439ACN105842439A权利要求书1/2页1.一种伏马毒素的定向免疫磁珠，其特征在于包含有磁珠载体、蛋白G或者蛋白A和伏马毒素抗体。2.根据权利要求1中所述的定向免疫磁珠，其特征在于蛋白G或者蛋白A通过共价键偶联在载体上，然后伏马毒素抗体与蛋白G结合，然后用交联剂交联，形成磁珠-蛋白G/蛋白A-伏马毒素抗体形式的偶联载体。3.根据权利要求1中所述的伏马毒素定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白G是天然的蛋白G或者基因重组表达的蛋白G。4.根据权利要求1中所述的伏马毒素定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白A是天然的蛋白A或者基因重组表达的蛋白A。5.根据权利要求3中所述的蛋白G，包括按照序列1表达的蛋白G，以及经过序列优化后表达的蛋白G。6.根据权利要求4中所述的蛋白A，包括按照序列2表达的蛋白A，以及经过序列优化后表达的蛋白A。7.根据权利要求1中所述的载体，包括纳米磁珠以及直径超过1μm的普通磁珠。8.根据权利要求2中所述的抗伏马毒素抗体，其特征在于包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。9.一种纯化伏马毒素的定向免疫磁珠制备方法，其特征在于：1）将磁珠用含0.01%SDS的50mMPH6.0MES缓冲液悬起；2）在磁珠中加入EDC至终浓度5-20mg/ml，再加入Sulfo-NHS至终浓度10-25mg/ml；3）室温反应15-60分钟；4）反应后的磁珠用50mMMES缓冲液PH6.0洗涤3次，然后重悬在50mMPH6.0的MES缓冲液中；5）将蛋白G或者蛋白A加入重悬后的磁珠中，使蛋白量与磁珠表面配基的摩尔比达到5-10:1；6）室温反应2-4小时；7）反应后的磁珠用50mMMES缓冲液PH6.0洗涤3次；8）反应后的磁珠用1M的乙醇胺室温封闭；9）磁珠用20mMPBS缓冲液PH7.4洗涤3次，然后重悬在20mMPBSPH7.4缓冲液中；10）在磁珠中加入抗伏马毒素抗体，使抗体量与磁珠中蛋白G量摩尔比达到3-5:1；11）将加入抗体的磁珠在37℃反应10-40分钟；12）磁珠用0.1M硼酸缓冲液PH9.0洗涤3次，然后磁珠重悬在1MPH9.0的硼酸缓冲液中；13）将伏马毒素抗体—蛋白G/蛋白A—磁珠载体加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的DMP，PH8.3.室温反应1-2小时；14）用50mMPH9.0的乙醇胺终止反应，用含有0.01%硫柳汞的10mMPBSPH7.4洗涤伏马毒素抗体—蛋白G/蛋白A—磁珠3次；15）将磁珠重悬在含有0.01%硫柳汞的10mMPBSPH7.4中，放于4℃保存。10.一种伏马毒素的定向免疫磁珠，其用途在于包括粮食、饲料、牛奶及乳制品、水产、血液、尿液、水中伏马毒素的分离纯化，纯化后的伏马毒素可以用于高效液相色谱及其它方2CN105842439A权利要求书2/2页法检测。3CN105842439A说明书1/6页一种伏马毒素定向免疫磁珠及其制备方法和用途技术领域[0001]本发明涉及一种伏马毒素的定向免疫磁珠及其制备方法和用途，属于伏马毒素纯化与检测领域。背景技术[0002]伏马毒素(Fumonisins)是一组主要由串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的真菌毒素。伏马毒素在自然界中分布广泛，且危害性大，逐渐引起了国内外学者的高度重视。目前，已发现的伏马毒素结构类似物主要分为A、B、C、P四类。研究证实伏马毒素可致马大脑白质软化症(EL-EM)，神经性中毒而表现意识障碍、