一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105671209A(43)申请公布日2016.06.15(21)申请号201610196404.1(22)申请日2016.03.30(71)申请人广东温氏食品集团股份有限公司地址527400广东省云浮市新兴县新城镇东堤北路9号(72)发明人卢围廖承球宋延华潘永飞宋爽王东东(74)专利代理机构广州番禺容大专利代理事务所(普通合伙)44326代理人刘新年(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页(54)发明名称一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法(57)摘要本发明公开了一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法，所述引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，所述探针如SEQIDNO:3所示。以待测样本的RNA反转录得到的cDNA作为模板，进行荧光定量PCR扩增，比较扩增曲线CT值。本发明通过在牛冠状病毒保守基因，即N基因处设计定量PCR引物，并采用探针法建立荧光定量PCR方法。本发明操作简单实用，特异性强、敏感度高，重复性好，适应现代化养殖场快速准确的检测需要。CN105671209ACN105671209A权利要求书1/1页1.一种检测牛冠状病毒的引物，其特征在于，所述引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的引物在制备检测牛冠状病毒的试剂盒中的应用。3.一种检测牛冠状病毒的探针，其特征在于，所述探针如SEQIDNO:3所示。4.根据权利要求3所述的检测牛冠状病毒的探针，其特征在于，所述探针的所述探针的3’端结合有荧光淬灭基团，5’端结合有荧光报告基团。5.根据权利要求4所述的检测牛冠状病毒的探针，其特征在于，所述荧光淬灭基团为TAMRA，所述荧光报告基团为FAM。6.一种检测牛冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和权利要求3～5任一项所述的探针。7.一种检测牛冠状病毒的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的引物和权利要求3～5任一项所述的探针，包括以下步骤：以待测样本的RNA反转录得到的cDNA作为模板，进行荧光定量PCR扩增，比较扩增曲线CT值；其中，所述荧光定量PCR的扩增体系为：q-pcrMix酶10μL，引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:2各0.2μL，SEQIDNO:3探针0.1μL，分子生物学用水7.46μL，Rox参比染料0.04μL，cDNA模板2μL；荧光定量PCR的扩增反应程序为：50℃2min；95℃2min，95℃3s，60℃30s，40个循环。8.根据权利要求7所述的检测牛冠状病毒的方法，其特征在于，所述反转录包括如下步骤：(1)、将RNA加入到预混液1中，混合均匀后，65℃保温5min后迅速冰上急冷3min，所述预混液1的配方为：50μM的RandomPrimer1μL，10mMeach的dNTPMixture1μL；(2)、将上述反应液加入到RT预混液2中反应如下：30℃10min、42℃60min、70℃15min，即得cDNA，所述预混液2的配方为：5×PrimeScriptBuffer4μL，40U/μL的RNaseInhibitor0.5μL，200U/μL的PrimeScriptReverseTranscriptase1μL，RNasefreeH2O4.5μL。2CN105671209A说明书1/5页一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法技术领域[0001]本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法。背景技术[0002]牛冠状病毒(bovinecoronavirus,BCV)是引起成年牛冬痢和新生犊牛腹泻(腹泻粪便中常带有血液和粘液)的最主要的病原之一，BCV的感染在全世界各国广泛分布。美国科学家Mebus等人(MebusCA,StairEL,RhodesMB,etal.Pathologyofneonatalcalfdiarrheainducedbyacoronavirus-likeagent[J].VetPathol,1973,10:45-64.)在发病的犊牛和成年牛的粪便病料中检出了BCV病毒，随后世界其他国家也报道了该病的发生。我国学者宋广林等人(宋广林，董惠兰，滕庆，等.犊牛流行性腹泻病原研究[J].畜牧兽医学报,1985,16:121-122.)于1985年首次报道了BCV在中国的存在，随后我国各地均有报道(傅彩霞，靳兴军，郑瑞峰，等.北京地区规模化奶牛场三种病毒性腹泻病的血清学调查[J].动物医学进展，2012.33(5):85-88)。