用于检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针、试剂盒和方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103088119A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103088119103088119A(43)申请公布日2013.05.08(21)申请号201210420204.1(22)申请日2012.10.29(71)申请人厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址361026福建省厦门市海沧区建港路2165号(72)发明人谢明星彭小莉刘棠陈伟玲王群力王景明徐维佳孙福泉王伟(74)专利代理机构厦门市新华专利商标代理有限公司35203代理人李宁(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书4页说明书4页序列表1页序列表1页附图2页附图2页(54)发明名称用于检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针、试剂盒和方法(57)摘要本发明公开了用于检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针。本发明还涉及用于检测牛白细胞粘附缺陷病的实时荧光定量PCR检测方法，所述方法包括本发明的引物和探针。本发明还涉及用于检测牛白细胞粘附缺陷病的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的引物和探针。本发明的实时荧光定量PCR检测方法，用于检测活体牛或非活体牛时，具有操作简便，耗时短，成本低，特异性强，重复性和稳定性高，灵敏度高的特点。CN103088119ACN10389ACN103088119A权利要求书1/1页1.用于检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针，其特征在于：引物包括上游引物：5’-TTGCGTTCAACGTGACCTTC-3’和下游引物5’-TCACCCCCCAGCTTCTTG-3’；探针包括突变型等位基因探针：HEX-5’-CCATCGGCCTGTAC-3’-MGB和野生型等位基因探针：FAM-5’-CCCATCGACCTGTACT-3’-MGB。2.用于检测牛白细胞粘附缺陷病的试剂盒，其特征在于：含有如权利要求1所述的引物和探针。3.用于检测牛白细胞粘附缺陷病的方法，其特征在于：使用如权利要求1所述的引物和探针或如权利要求2所述的试剂盒，采用实时荧光定量PCR的方法，包括实时荧光定量PCR反应体系的配制及实时荧光定量PCR反应。4.如权利要求3所述的用于检测牛白细胞粘附缺陷病的方法，其特征在于：在实时荧光定量PCR反应之前，还包括提取牛血总DNA的步骤。5.如权利要求4所述的用于检测牛白细胞粘附缺陷病的方法，其特征在于：实时荧光定量PCR反应体系的配制，总体积为50μL，配制如下：TaqManFastUniversalPCRMasterMix(2×)25μL；上游引物（10μmol/L）1μL；下游引物（10μmol/L）1μL；突变型等位基因探针（10μmol/L）1μL；野生型等位基因探针（10μmol/L）1μL；DNA模板（25ng/μL）5μL；补水至50μL。6.如权利要求5所述的用于检测牛白细胞粘附缺陷病的方法，其特征在于：实时荧光定量PCR反应包括以下步骤：1）95℃变性10min；2）95℃变性30s，60℃退火延伸1min，循环40次。2CN103088119A说明书1/4页用于检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针、试剂盒和方法技术领域[0001]本发明属于动物检测生物技术领域，具体涉及应用实时荧光定量PCR的方法检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针、试剂盒和方法。背景技术[0002]牛白细胞粘附缺陷病（(bovineleukocyteadhesiondeficiency,BLAD）是一种常染色体单基因隐性遗传疾病，它的特征表现为严重的重复性感染、伤口愈合延迟和发育不良，而且还伴有明显的持续性中性粒细胞增多。BLAD发生的分子生物学理论根据是在基因CD18的383的位置上发生点突变，腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即导致在粘附分子CD18的氨基酸128天门冬氨基酸由甘氨酸代替（D128G）。患有BLAD牛的中性粒细胞的白细胞粘附分子的β2整合素（CD11a,b,c/CD18）的表达出现障碍，致使白细胞粘附依赖性功能表现出明显的异常。[0003]1983年，报道了一例Holstein小母牛发病，怀疑是白细胞功能障碍，称为粒细胞病。1987年，日本报道有几例Holstein牛与持续性和反复性中性粒细胞病有相似的临床特征。[0004]1990年，人们从一头患粒细胞综合症的牛身上发现β2整合素分子在白细胞上的表达缺陷，这种病与人LAD是非常相似的，因此命名为BLAD。[0005]二十多年来已给奶牛业带来了巨大的经济损失。目前本病在澳大利亚、英格兰、法国、美国、日本、德国、荷兰、丹麦和瑞士等国均有发生的报道，2006年我国也发现有BLAD携带牛的报道。近几年来鉴于我国大量引进奶牛及其精液，不可避免地将BLAD带入，而目前有关B