同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR方法及引物探针以及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105969839A(43)申请公布日2016.09.28(21)申请号201510212723.2(22)申请日2015.04.29(71)申请人汕头市检测检验学会地址515000广东省汕头市海滨路12号汕头科技馆4楼申请人中华人民共和国汕头出入境检验检疫局(72)发明人吴图扬许如苏段建发林宏梁希扬徐宁张杨其他发明人请求不公开姓名(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书5页序列表2页附图3页(54)发明名称同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR方法及引物探针以及试剂盒(57)摘要本发明公开一种同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的方法。本发明利用序列相对较短但Tm较高的LNA探针序列，可在确保特异性的前提下，有效提高体系的稳定性，建立了一套多重荧光定量PCR检测体系，该体系能够同时检测牛、猪源性成分，可检测肉或肉制品中DNA含量低至0.05ng的牛源性成分和0.05ng的猪源性成分，相当于可检测含量约0.005%的对应动物成分。本发明的方法具有通量高、特异性强、灵敏度高、应用性好等优点，能较好应用于肉及肉制品中牛、猪源性成分的检测。CN105969839ACN105969839A权利要求书1/2页1.同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的引物探针组，包括牛源性成分特异性引物和探针，猪源性成分特异性引物和探针，其中引物和探针以及序列为：牛源性成分的上游引物N-F5'-ttgaattaggccatgaagca-3'；牛源性成分的下游引物N-R5'-cgacttgtctcctctcatgtagc-3'；牛源性成分的探针T15’-FAM-cgcccgtcaCcctcctcaaata-BHQ1-3'；猪源性成分的上游引物Z-F5’-aaccccgatagaccttaccaa-3'；猪源性成分的下游引物Z-R‘5-tcctttttagggtttgctgaag-3'；猪源性成分的探针T2‘5-Rox-tgccaattcagcctatataCCgcca-BHQ2-3'；其中探针中的“C”为LNA修饰碱基，FAM和ROX为荧光基团，BHQ1和BHQ2为猝灭基团。2.同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的检测试剂盒，包括如下成分：。3.同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的方法，包括以下步骤：（1）待检样品DNA的提取，将样品与水按照1:4的比例（M/V）进行匀浆，取制备的悬浊液50μL，采用试剂盒法提取DNA，但将DNA的定容体积改为100μL；试剂盒可选用WizardGenomicDNApurificationkit、核酸提取试剂盒、动物组织基因组DNA提取试剂盒等DNA提取试剂盒；（2）多重荧光定量PCR，，荧光定量PCR反应条件为：95°C30s；95°C5s，59°C25s，35个循环，在每个循环的59°C阶段结束后收集FAM和ROX的荧光信号；其反应体系如下所示：2CN105969839A权利要求书2/2页（3）结果判断：根据FAM和ROX两个通道下的循环阈值,该值为Ct值进行判断，其中FAM通道下是牛源性成分的检测，ROX通道下是猪源性成分的检测；若阳性对照Ct值≤18，阴性对照无Ct值或Ct≥30，则试验有效；当样品Ct值≤25时判为阳性，即样品中含有牛源性成分—FAM通道和/或猪源性成分—ROX通道；当样品Ct值≥30或无Ct值时判为阴性，即样品中不含有牛源性成分—FAM通道和/或猪源性成分—ROX通道；当25＜样本Ct值＜30时须复检，复检结果与原结果一致的判为弱阳性，提示样品中含有微量，即被污染的牛源性成分—FAM通道和/或猪源性成分—ROX通道。3CN105969839A说明书1/5页同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR方法及引物探针以及试剂盒技术领域[0001]本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种同时检测肉或肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的方法和引物探针组。[0002]背景技术[0003]肉或肉制品的掺假一直是消费者关注的焦点问题之一，有些不法商家为了个人利益，以低价肉制品假冒高价肉制品，或在高价肉制品中掺入低价肉，这严重损害了消费者的权益。目前，打击肉制品掺假已成为监管部门关注的重点，而肉或肉制品的成分检测技术是监管的基础。[0004]目前，动物源性成分的检测技术以检测DNA为基础的分子生物学方法应用最为广泛，