一种基于微滴式数字PCR的牛、猪源性成分定量检测方法、引物和探针及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106676189A(43)申请公布日2017.05.17(21)申请号201710100046.4(22)申请日2017.02.23(71)申请人珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址519015广东省珠海市香洲区九洲大道东1144号(72)发明人黄永辉张卫东廖力徐淼锋迟远丽权永兵(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人李先林(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表2页附图2页(54)发明名称一种基于微滴式数字PCR的牛、猪源性成分定量检测方法、引物和探针及试剂盒(57)摘要本发明涉及分子生物学领域，公开了一种利用微滴式数字PCR技术对牛、猪源性成分进行定量检测的方法，以及在该方法中用到的引物和探针组合、相应的试剂盒。引物和探针的序列为SEQIDNo.1~6。本发明方法适用于掺杂了猪肉的牛肉或牛肉制品中牛成分的定量检测，克服了实时荧光PCR定量检测需要依赖标准品的缺陷，在没有任何标准物或参照物的情况下，该方法能通过准确测定两种肉成分的核酸拷贝数，从而计算出某一种肉成分的准确含量，对市场打假维护消费者权益具有非常重要的实际意义。CN106676189ACN106676189A权利要求书1/1页1.一种基于微滴式数字PCR的牛、猪源性成分定量检测的引物和探针，包括：两条检测牛源性成分的引物，其序列分别为Bov-BGH-F：5′-CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3′；Bov-BGH-R：5′-GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3′；一条检测牛源性成分的探针，其序列为Bov-BGH-Pr：5′-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-3′；两条检测猪源性成分的引物，其序列分别为Sus-β-Actin-F：5′-CGAGACCTTCAACACCCCAG-3′；Sus-β-Actin-R：5′-GGCGTACCCCTCGTAGATG-3′；一条检测猪源性成分的探针，其序列为Sus-β-Actin-Pr：5′-TGTGGGTGACCCCGTCTCCGGA-3′。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述Bov-BGH-Pr的5′端标记有荧光报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述Sus-β-Actin-Pr的5′端标记有荧光报告基团HEX，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ1。3.一种基于微滴式数字PCR的牛、猪源性成分定量检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物和探针。4.一种基于微滴式数字PCR的牛、猪源性成分定量检测方法，其特征在于，包括使用权利要求1或2所述引物和探针进行PCR扩增的步骤。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取样品基因组DNA；S2、将权利要求1或2所述引物和探针加入反应体系中进行双重PCR扩增反应；S3、将PCR产物置于数字PCR仪中读数分析。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，PCR反应体系总体积为20μL，各组分如下：2×ddPCRSupermix混合反应液10μL，引物Bov-BGH-F、Bov-BGH-R、Sus-β-Actin-F、Sus-β-Actin-R各1μL，探针Bov-BGH-Pr、Sus-β-Actin-Pr各1μL，模板DNA2μL，加ddH2O补足至20μL。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，PCR扩增反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性15s，55℃退火10s，68℃延伸20s，40个循环；扩增结束后进行98℃10min的酶热失活。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物Bov-BGH-F、Bov-BGH-R、Sus-β-Actin-F、Sus-β-Actin-R的使用终浓度均为900nmol/L，所述探针Bov-BGH-Pr、Sus-β-Actin-Pr的使用终浓度均为250nmol/L。2CN106676189A说明书1/6页一种基于微滴式数字PCR的牛、猪源性成分定量检测方法、引物和探针及试剂盒技术领域[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体来说是一种利用微滴式数字PCR技术对牛、猪源性成分进行定量检测的方法，以及在该方法中用到的引物和探针组合、相应的试剂盒。背景技术[0002]近年来，遭到媒体曝光的阿胶不含驴皮成分，假牛肉，假猪蹄，用鸭肉制成涮羊肉和烤串，花旗参里掺萝卜干，山寨蜂胶，假鱼丸、假燕窝、假虫草等掺假售假事件，涉及集贸市场、餐饮饭馆，乃至深受消费者信赖的知名超市以及各大电商平台。面对这些真假难辨的食品和保