一种DNA pulldown方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106093437A(43)申请公布日2016.11.09(21)申请号201610633292.1(22)申请日2016.08.03(71)申请人广州伯信生物科技有限公司地址510000广东省广州市广州高新技术产业开发区科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器D区D1008号(72)发明人王晓香董先辉张娟曾健周剑(74)专利代理机构北京市盈科律师事务所11344代理人刘雪花(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图1页(54)发明名称一种DNApulldown方法及试剂盒(57)摘要本发明涉及一种DNApulldown方法及试剂盒。所述方法包含以下步骤：S1、磁珠预处理：使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S2、制备探针-磁珠复合物；S3、提取并预处理细胞核蛋白：向提取核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；S4、pulldown；S5、蛋白样品的收集。本发明具有如下有益效果：本发明通过预先使用BSA、寡核苷酸随机引物封闭磁珠，降低了磁珠与蛋白、基因组DNA的非特异性结合。本发明通过系统性核酸酶防护，防止核酸酶的污染，增加了实验的稳定性和可靠性，重复性好，简化了实验流程。CN106093437ACN106093437A权利要求书1/2页1.一种DNApulldown方法，其特征在于，包含以下步骤：S1、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S2、制备探针-磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的DNA探针结合；S3、提取并预处理细胞核蛋白：向提取核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；S4、pulldown：将步骤S3制备的蛋白样品加入到步骤S2制备的探针-磁珠复合物中，加入DNAprecipitationbuffer及脱氧核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用DNAprecipitationbuffer洗涤磁珠，得到蛋白-探针-磁珠复合物；S5、探针-蛋白复合物的收集：将步骤S4制得的蛋白-探针-磁珠复合物加入UreaCHAPSbuffer孵育，去除磁珠，收集上清即得探针-蛋白复合物。2.根据权利要求1所述的DNApulldown方法，其特征在于，所述步骤S1磁珠预处理的方法为：用1mL1×TES洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TES洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液。3.根据权利要求2所述的DNApulldown方法，其特征在于，所述TES中BSA的浓度为0.05-0.5wt％，寡核苷酸随机引物的浓度为10-20μmol/L。4.根据权利要求1或2所述的DNApulldown方法，其特征在于，所述步骤S1中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列。5.根据权利要求1所述的DNApulldown方法，其特征在于，所述步骤S2制备探针-磁珠复合物的方法为：向2-5μgDNA探针中加入DNAstructurebuffer至100μL，再将其加入步骤S1中预处理的磁珠中，并加入100μL2×TES，25℃温和旋转混合30-60min，去上清；用1×TES洗涤磁珠两次，去除TES。6.根据权利要求1所述的DNApulldown方法，其特征在于，所述步骤S3中预处理细胞核蛋白的方法为：向1.5×107个细胞提取获得的核蛋白提取物中加入5μLDNase和1.6μLDNaseBuffer，25℃温和孵育1h；再加入40μL未预处理的磁珠，4℃温和旋转30min；上清液为预处理的核蛋白。7.根据权利要求1所述的DNApulldown方法，其特征在于，所述步骤S3提取细胞核蛋白的方法为：用含0.5mMPMSF的PBS洗涤1.5×107个细胞两次，每次4℃、1000rpm离心5min，弃上清；加入390μL预冷Buffer1、4μL10mg/mL的PMSF溶液、4μLproteaseinhibitorcocktail和2μL100mMDTT溶液，重悬细胞后，剧烈涡旋10秒钟充分混匀，冰浴10min；4℃、1400g-2500g离心5min，弃上清；加入390μL冷Buffer2、4μL10mg/mL的PMSF溶液、4μLproteaseinhibitorcocktail和2μL100mMDTT溶液，涡旋充分重悬沉淀，冰浴20min，每隔2min高速剧烈涡旋15-30秒钟充分混匀；4℃、12,000g-16,000g离心10min，弃沉淀，上清为核蛋白提取物；所述Buffer1的配方为：10mMHEPES-KOH、1.