一种FII-RNA pulldown试剂盒和方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113817724A(43)申请公布日2021.12.21(21)申请号202111160837.9(22)申请日2021.09.30(71)申请人广州辉骏生物科技股份有限公司地址510663广东省广州市广州高新技术产业开发区科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器D504-505(72)发明人刘郁林张超屈义(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569代理人高辉(51)Int.Cl.C12N15/11(2006.01)C07K1/14(2006.01)G01N33/68(2006.01)权利要求书2页说明书16页序列表4页附图3页(54)发明名称一种FII-RNApulldown试剂盒和方法及其应用(57)摘要本发明提供了一种FII‑RNApulldown试剂盒和方法及其应用，属于生物技术领域，所述FII标签是一段短RNA序列，与目标RNA序列融合表达时，几乎不影响目标RNA的结构或功能。在进行RNApulldown时，由于FII标签与配体的强亲和力，预先偶联在磁珠上的配体会高效捕获目标RNA‑FII，再与待测蛋白样品混合孵育后，即可调取目标RNA的结合蛋白，整个过程操作简单、省时、RNA也不易降解。在体外转录或者体内表达获得目标RNA‑FII后，无需对转录后的RNA进行纯化，操作简单，方便，应用范围广泛。CN113817724ACN113817724A权利要求书1/2页1.一种FII标签，其特征在于，所述FII标签为一段短RNA序列，所述FII标签的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种RNApulldown试剂盒，其特征在于，包括下述试剂：链霉亲和素磁珠，配体，RNAstructurebuffer，RIPA裂解缓冲液，NT2缓冲液，漂洗液，洗脱缓冲液，磷酸盐缓冲液，蛋白酶抑制剂，RNA酶抑制剂。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述配体为：1)SEQIDNO.2所示的多肽；2)1)中的氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或几个氨基酸后形成的仍然具有改造前与FII标签高度亲和力的多肽。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述RIPA裂解缓冲液可应用于多种细胞类型，所述细胞类型包括：Hela，jurkat，A431，A549，MOPC，NIH/3T3，U2OS。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂为PMSF或Cocktail；所述RNA酶抑制剂为RecombinantRNaseInhibitor或SUPERaseInTMRNaseInhibitor。6.一种RNApulldown方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、通过体外转录或体内表达制备目标RNA‑FII；S2、磁珠预处理：向50uL磁珠中加入0.5mLNT2缓冲液，去掉NT2缓冲液，重复洗涤1次；用200μLNT2缓冲液重悬磁珠，并加入20uL配体，混合器孵育，使配体固定在磁珠上；取上述磁珠，加入0.5mL漂洗液，去掉漂洗液，重复操作1次，加入300μLNT2缓冲液重悬磁珠，得到配体磁珠，备用；S3、利用磁珠上的特异性配体捕获目标RNA‑FII：将S1所得的目标RNA‑FII加入到S2所得的配体磁珠中，室温混合孵育30min；S4、提取细胞全蛋白：取待测细胞经磷酸盐缓冲液漂洗得到细胞沉淀，向所述细胞沉淀中加入150uL包含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，通过超声破碎或者加完裂解缓冲液后反复冻融破碎，离心，收集上清液，‑80℃保存；S5、pulldown：将S4所得上清液与S3所得捕获目标RNA‑FII的磁珠室温混合孵育1h；将孵育好的磁珠‑目标RNA‑蛋白混合物去掉上清，依次经漂洗液和NT2缓冲液漂洗后离心收集磁珠，所得磁珠用洗脱缓冲液进行洗脱，经离心后得到上清液即为所述目标RNA结合蛋白复合物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述S1体外转录制备目标RNA‑FII的步骤包括：1)PCR获得T7‑RNA‑FII转录模板，通过T7RNA聚合酶体外转录得到带有FII标签的目标RNA；2)将步骤1)所得目标RNA变性后离心，向离心所得沉淀中加入RNAstructurebuffer和RNA酶抑制剂，室温放置30min，即得包含FII标签的目标RNA。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述S1体内表达制备目标RNA‑FII的步骤包括：构建RNA‑FII质粒载体，转染宿主细胞，使其在体内转录得到带FII标签的目标RNA。9.权利要求1所述的FII标签或权利要求2‑5任一项所述的试剂盒在体内和体外RNApulldown中的应用。2CN113817724A权利要求书2/2页10.权利要求1所述的FII标签或权利要求2‑5任一项所述的试剂盒在线性RNA或环