抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法及其用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106565843A(43)申请公布日2017.04.19(21)申请号201610934548.2(22)申请日2016.11.01(71)申请人浙江大学地址310058浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号(72)发明人郑晓冬李洪波楚强(74)专利代理机构杭州中成专利事务所有限公司33212代理人金祺(51)Int.Cl.C07K16/26(2006.01)C12N5/20(2006.01)G01N33/74(2006.01)G01N33/543(2006.01)G01N33/577(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图1页(54)发明名称抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法及其用途(57)摘要本发明公开了一种抗黄体酮类兔単克降抗体的制各方法及其用途。本发明选取黄体酮类药物与载体蛋白牛血清白蛋白偶联合成免疫抗原，将这种免疫抗原采用背部皮下注射免疫兔子，经过杂交瘤技术，最终得到抗黄体酮类兔単克降抗体。本发明制备的抗体为兔单克降抗体，兔单克降的制备优于鼠单克降抗体。兔子相比于小鼠可以识别更多免疫抗原的表位。其次，兔脾脏较大可以进行更多的融合实验，使高通量筛选融合细胞成为可能。本发明可用于食品、饲料及环境样品中的黄体酮类药物的残留检测。CN106565843ACN106565843A权利要求书1/2页1.抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)、将40mg黄体酮溶解于1mL的二甲基甲酰胺和1mL二氧六环中，4℃预冷后，加入30μL三丁胺，冰浴10分钟后加入40μL氯甲酸异丁西言，反应20分钟，得到黄体酮溶液反应液，将80mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH9.6碳酸缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将黄体酮溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到黄体酮免疫抗原，-20℃保存；2)、将这种免疫抗原釆用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2m1，第一次免疫将黄体酮免疫抗原0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将这种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫问隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4-8周内，将黄体酮免疫抗原0.5mg静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；3)、无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为:在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后高心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2X108个脾淋巴细胞的悬液备用；4)、将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫免子的脾细胞融合，融合剂为50％的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；5)、融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6％C02培养箱内培养，2-3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克降化，每个多克降分装于3块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用于扩大培养生产抗黄体酮类兔单克降抗体。2.根据权利要求1所述的抗黄体酮类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的将免疫兔子的脾脏细胞与240E细胞融合步骤为:分别取2×108个脾淋巴细胞和1x108个240E细胞混匀，加1640培养液后离心，弃上清，使两种细胞充分混匀成糊状，37℃水浴预温，缓缓加入经37℃预温的50％聚乙二醇溶液，再加入经37℃预温的1640培养液，使聚乙二醇稀释而失去作用，补加1640培养液后离心，弃上清，将融备后的细胞沉旋悬浮于HAT培养液中。3.根据权利要求1所述的抗黄体酮类兔単克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述黄体酮类药物结构通式为：4.抗黄体酮类兔单克隆抗体的用途，其特征在于：用于制备检测黄体酮类药物残留的2CN106565843A权利要求书2/2页ELISA检测试剂金。5.根据权利要求4所述的抗黄体酮类兔单克隆抗体的