一种用于检测乳铁蛋白含量的适配体及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106645050A(43)申请公布日2017.05.10(21)申请号201610894671.6(22)申请日2016.10.13(71)申请人南京大学地址210046江苏省南京市栖霞区仙林大道163号南京大学(72)发明人许丹科李慧陈竹刘晓辉(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙)32204代理人丁静静肖明芳(51)Int.Cl.G01N21/64(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表15页附图3页(54)发明名称一种用于检测乳铁蛋白含量的适配体及其应用(57)摘要本发明公开了一种用于检测乳铁蛋白含量的适配体，所述适配体的核苷酸序列如SEQIDNO.5～65所示。本发明还公开了利用上述适配体检测乳铁蛋白的方法，该方法以荧光标记的适配体作为探针分子，通过适配体与乳铁蛋白的特异性结合使荧光偏振信号发生变化。荧光偏振信号与乳铁蛋白浓度之间存在线性关系从而实现对乳铁蛋白的定量检测。此方法灵敏度高，特异性好，检测的线性范围为0.78～50μg/mL。该方法能实现对复杂样品中目标物的测量，如牛奶中乳铁蛋白的测量。此外，该方法使用BioTeK酶标仪对96孔板直接扫描，达到了快速、高通量测量的要求，可以同时对多个样品进行有效测量。CN106645050ACN106645050A权利要求书1/1页1.一种用于检测乳铁蛋白含量的适配体，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列如SEQIDNO.5～65所示。2.权利要求1所述用于检测乳铁蛋白含量的适配体在检测乳铁蛋白中的应用。3.一种荧光偏振法测量阴性蛋白含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)绘制标准曲线：将10μL、40nM～4000nM异硫氰酸荧光素标记的适配体溶液中加入100μL不同浓度的阴性蛋白标准样品，混匀，所述适配体的核苷酸序列为SEQIDNO.1～61中的任一种，25℃～40℃下反应5～120min，用酶标仪检测，激发波长为480nm，发射波长为528nm，绘制标准曲线；(2)样品检测：将异硫氰酸荧光素标记的适配体与待测样品混合，按照步骤(1)的条件检测。4.根据权利要求3所述的荧光偏振法测量阴性蛋白含量的方法，其特征在于，所述异硫氰酸荧光素标记的适配体的浓度为40nM～4000nM。5.根据权利要求3所述的荧光偏振法测量阴性蛋白含量的方法，其特征在于，所述待测样品的浓度为0.78～50μg/mL。6.根据权利要求3所述的荧光偏振法测量阴性蛋白含量的方法，其特征在于，所述的阴性蛋白为乳铁蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、BSA。2CN106645050A说明书1/5页一种用于检测乳铁蛋白含量的适配体及其应用技术领域[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种使用荧光偏振法对乳铁蛋白进行检测的适配体及其应用。背景技术[0002]荧光偏振技术作为一种简单可靠的信号传导手段，可以基于荧光基团的分子质量的变化提供关于分子取向、迁移和作用过程的信息。荧光偏振分析法具有很多的优势：第一，它是一种均相分析方法且灵敏度高，无需分离等复杂操作，结果重现性好；第二，响应时间快，可以实时监测分子间相互作用；第三，可以与酶标仪等仪器联用，可以实现自动化高通量测定；第四，荧光偏振依赖于两个垂直方向上的荧光强度的比值，与荧光绝对强度无关，荧光偏振值对荧光的波动及光漂白不敏感，从而成为在复杂生物样品中均相测定目标分子的理想分析方法。因此，荧光偏振技术在荧光传感应用中受到广泛的研究关注。[0003]乳铁蛋白是一种极具广阔市场前景的功能性蛋白，它主要存在于哺乳动物的乳汁中，其含量与动物的种属息息相关，以人乳、牛乳为典型代表。研究表明，乳铁蛋白具有多种生物学活性。它具有参与铁代谢、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、阻断氧自由基、免疫调节及抗炎症、促进细胞增长、减少内脏脂肪等多种功能。且由于乳铁蛋白是一种可被婴儿摄入的、安全极高的天然乳成分，其在日本被批准为食品添加剂，在美国被纳入一般认为安全物质之中。加之，乳铁蛋白广泛的生物学功能深受国内外食品相关企业的高度重视，在我国GB14880—2012《食品营养强化剂使用标准》中，乳铁蛋白也被列为一种新型营养强化剂并规定了其在相关乳制品中的含量标准。因而，能否建立快速准确的乳铁蛋白检测技术对于食品安全来说至关重要。目前，适合不同类型生物样品中乳铁蛋白的检测技术主要有分光光度法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、高效亲和色谱法、高效毛细血管电泳法以及表面等离子共振技术等检测技术，但这些方法依然存在前处理过程复杂、实际样品回收率低、稳定性差等特点，因此建立出一种能够全面实现准确、快速、无需对样品进行前处理的全自动乳铁蛋白检测方法十分重要且紧迫。发明内容[0004]本发明所要解决的技