一种配体修饰的磁性纳米粒子制备及其快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109575127A(43)申请公布日2019.04.05(21)申请号201710898752.8(22)申请日2017.09.28(71)申请人中国海洋大学地址266100山东省青岛市市南区鱼山路5号(72)发明人张兰威张基亮韩雪(51)Int.Cl.C07K14/79(2006.01)C07K1/22(2006.01)H01F1/00(2006.01)权利要求书2页说明书5页附图2页(54)发明名称化生产。一种配体修饰的磁性纳米粒子制备及其快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法(57)摘要本发明涉及一种配体修饰的磁性纳米粒子快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法，具体顺序为制备磁性纳米粒子，将配体连接到磁性纳米粒子上制成修饰的磁性纳米粒子；将修饰后的磁性纳米粒子与乳清混合后，经过几分钟的吸附和洗脱后，即可快速高效地获得乳铁蛋白，并回收磁性纳米粒子。本发明磁性纳米粒子回收率高大于99.99%、回收简单、可将使用后的磁性纳米粒子在pH6.0磷酸盐缓冲液中4℃保存，使之可多次重复使用，经过100次吸附后磁性纳米粒子的吸附稳定性高于89%，该磁性纳米粒子对乳清中的乳铁蛋白最大吸附能力为11.5mg/g、每克磁性纳米粒子可以使35mL含乳铁蛋白为0.35mg/mL乳清中乳铁蛋白的回收率达到90%以上、获得的乳铁蛋白的纯度高于93%、最佳吸附和洗脱时间为4-7min、获得一种高效提取效率的方法，本方CN109575127A法特点是可操作性强，提取一步完成，适于工业CN109575127A权利要求书1/2页1.一种配体修饰的磁性纳米粒子制备及其快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法，其特征在于，该方法只需将配体修饰的磁性纳米粒子与乳清混合经过几分钟的吸附和洗脱即可快速高效地获得乳铁蛋白，且磁性纳米粒子回收率高、回收方法简单、磁性纳米粒子可多次重复使用、保存简单，本方法按照以下步骤进行：（1）磁性纳米粒子制备：将一定量的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O用去离子水溶解，通入N25-15分钟后，在搅拌的条件下用氨水或者盐酸调节溶液的pH值至6.0-12.0，然后将该溶液置于水浴锅中，于70-95℃反应20-40min，反应结束后用去离子水和/或无水乙醇各洗涤3-5次后，将洗涤后的沉淀在50-85℃的真空干燥箱内烘干，烘干后研磨；（2）磁性纳米粒子配体的修饰：0.02-0.1g磁性纳米粒子溶解于15-25mLpH5-7.5磷酸缓冲液中，超声20-35min后加入3-7mL浓度为15-30mg/mL的腈胺溶液继续超声20-35min，加入0.5-1.0mL浓度为0.7-1.5mg/mL的刀豆蛋白A后超声20-35min后，用双蒸水洗涤3-5次后收集磁性纳米粒子；（3）磁性纳米粒子吸附乳清中乳铁蛋白与洗脱：每克修饰配体后的磁性纳米粒子与35mL乳清混合进行吸附与洗脱，磁性纳米粒子对乳清中的乳铁蛋白最大吸附能力为11.5mg/g、乳清中乳铁蛋白的回收率达到90%、乳铁蛋白的纯度高于93%、最佳吸附和洗脱时间为4-7min、磁性纳米粒子的回收率大于99.99%；将使用后的磁性纳米粒子在pH6.0磷酸盐缓冲液中4℃保存，多次重复使用，经过100次吸附后磁性纳米粒子的吸附稳定性高于89%。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的磁性纳米粒子直径为13.83±1.26nm，经配体修饰后的磁性纳米粒子直径为20.33±1.53nm。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在pH6.0磷酸盐缓冲液中加入终浓度为0.001-0.005M的NaCl，可在超声制备磁性纳米粒子后加速其沉降收集。4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述磁性纳米粒子吸附乳清中乳铁蛋白与洗脱就是磁性纳米粒子与乳清混合，在120r/min的条件下吸附1-10min，吸附结束后，用磁铁吸附磁性纳米粒子后，倾倒出液体用双蒸水清洗剩余物（沉淀物）2次，每次清洗沉淀以后都用磁性吸附磁性纳米粒子，小心地去除双蒸水，然后加入洗脱液进行120r/min洗脱5min，用磁铁吸附磁性纳米粒子后，收集洗脱液，所得到的洗脱液通过BCA蛋白测定试剂盒测定其蛋白浓度，同时将洗脱液进行12%的SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后分析各洗脱液中乳铁蛋白占总蛋白的比例，结合总蛋白量和乳铁蛋白所占的比例来确定最佳吸附时间；以最佳的吸附时间为准，以同样的方式来确定最佳洗脱时间；将10mL在最佳吸附和洗脱时间条件下得到的洗脱液与10mL硝酸混合后进行消化，以双蒸水和10mL为空白对照，消化结束后将所剩的灰分容10mL后用电感耦合等离子体发射光谱仪测定溶液中的铁离子浓度来确定磁铁对乳清中磁性纳米粒子的回收率；磁性纳米粒