一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114791500A(43)申请公布日2022.07.26(21)申请号202210460202.9(22)申请日2022.04.28(71)申请人山东省农业科学院地址250100山东省济南市历城区工业北路202号(72)发明人朱超颜朦朦张帆李慧冬陈子雷秦宏伟(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569专利代理师薛红凡(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)G01N33/535(2006.01)权利要求书1页说明书11页序列表1页附图5页(54)发明名称一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒及其应用(57)摘要本发明提供了一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒及其应用，属于核酸检测技术领域。本发明应用核酸适配体进行酶联核酸适配体乳铁蛋白的检测试剂盒。采用间接竞争的方法，将辣根过氧化物酶标记的核酸适配体顺序性地与待测样品、及固定于微孔板上的互补核酸分子反应，再加入酶催化底物进行催化反应，读取检测信号，根据信号变化检测乳铁蛋白含量。本发明采用96孔板作为固相基底，利用酶标仪进行信号检测，便于快速检测多个样品，具有高通量，同时本发明提供的酶联核酸适配体检测乳铁蛋白的方法具有较高的灵敏度和稳定性，适用于市场上配方奶粉、液体奶、乳铁蛋白营养滴剂等乳制品的快速检测。CN114791500ACN114791500A权利要求书1/1页1.一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括以下组成：酶标记的乳铁蛋白核酸适配体、互补核酸分子包被的微孔板；所述乳铁蛋白核酸适配体的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述互补核酸分子的序列与所述乳铁蛋白核酸适配体互补。2.根据权利要求1所述乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，在所述酶标记的所述乳铁蛋白核酸适配体中，所述酶和乳铁蛋白核酸适配体通过生物素‑链霉亲和素系统连接；在所述互补核酸分子包被的微孔板中，所述互补核酸分子和微孔板通过生物素‑链霉亲和素系统连接。3.根据权利要求2所述乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，在互补核酸分子包被的微孔板中，所述互补核酸分子的包被浓度为100～600nM。4.根据权利要求3所述乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述互补核酸分子的长度为乳铁蛋白核酸适配体总长度的40％～100％。5.根据权利要求2所述乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记的所述乳铁蛋白核酸适配体中酶包括以下一种或几种：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和核酸内切Cas酶。6.根据权利要求1～5任意一项所述乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，还包括以下一种或几种：酶催化底物显色液、洗涤液、终止液、样品提取液和样品稀释液。7.权利要求1所述乳铁蛋白核酸适配体或权利要求2～6任意一项所述试剂盒在检测乳制品中乳铁蛋白含量中的应用。8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述乳制品包括奶粉、液体奶、滴剂。9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，待检测乳制品中乳铁蛋白的浓度为1.2nM～25nM。10.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述检测乳制品中乳铁蛋白含量的方法，包括以下步骤：1)取待测样品溶于样品提取液中，离心过膜，稀释得到前处理样品；2)将酶标记的核酸适配体加入前处理样品中，孵育，得到反应液A；3)向互补核酸分子包被的微孔板中加入所述反应液A，孵育，洗涤，拍干；4)向步骤3)中拍干后的微孔板中加入显色液进行显色反应，加终止液终止，使用酶标检测仪读取吸光度值，根据标准方程计算待测样品中乳铁蛋白的含量。2CN114791500A说明书1/11页一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒及其应用。背景技术[0002]乳铁蛋白(Lf)是一种分子量约为80kDa的铁结合糖蛋白，存在于大多数哺乳动物的乳汁和哺乳动物外分泌物中，在先天免疫系统中起重要作用，能够增强机体对疾病的抵抗力，以及抗菌、抗癌和抗氧化的能力。乳铁蛋白在哺乳动物乳汁中含量丰富，如牛奶中的含量为0.02～0.35mg/mL，其蛋白质结构和氨基酸序列与人乳铁蛋白高度相似，易于被婴儿和儿童吸收。因此，乳铁蛋白已被广泛用作婴幼儿食品(尤其是奶粉)的营养强化剂，可改善婴幼儿肠道菌群，促进铁吸收，增强婴幼儿免疫力，减少脂类氧化反应。对婴幼儿尤其是非母乳喂养的婴幼儿来说，奶粉的意义重大。2012年我国食品安全国家标准GB14880‑2012将乳铁蛋白列为营养强化剂，规定乳制品和婴幼儿配方奶粉中添加的乳铁蛋白允许量不得超过≤1g/kg。由于乳铁蛋白天然存在于哺乳动物的乳汁中，因此，对乳制品中外来与内在的乳铁蛋白含量的检测非常必要。[0003]核酸适配体(Aptamer)是从寡聚核苷酸文库中