一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液及其制备方法和应用、牛乳铁蛋白的检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114414687A(43)申请公布日2022.04.29(21)申请号202210034444.1(22)申请日2022.01.13(71)申请人北京美正生物科技有限公司地址102101北京市延庆区风谷四路8号院2号楼1-4层申请人山东美正生物科技有限公司(72)发明人田秀梅武冬霞顾浩柳家鹏(74)专利代理机构北京方圆嘉禾知识产权代理有限公司11385代理人任霜(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/86(2006.01)权利要求书1页说明书12页附图1页(54)发明名称一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液及其制备方法和应用、牛乳铁蛋白的检测方法(57)摘要本发明提供了一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液及其制备方法和应用、牛乳铁蛋白的检测方法，属于蛋白质检测技术领域。本发明所述结合缓冲液作为乳铁蛋白的提取液，能够保证亲和柱对乳品中乳铁蛋白的结合能力，可实现对样本中乳铁蛋白的富集和检测，提高了产品中乳铁蛋白的提取率和回收率，克服样本基质对目标物质的影响，能够适用不同类型乳品中乳铁蛋白的提取，可满足不同类型乳品中乳铁蛋白的定量检测，且回收率均能达到90％以上，结果稳定，且洗脱后峰形好，杂质峰少。CN114414687ACN114414687A权利要求书1/1页1.一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液，其特征在于，包括以下制备原料：十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、提取试剂和水；所述十二水合磷酸氢二钠在结合缓冲液中的浓度为30.083g/L；所述二水合磷酸二氢钠在结合缓冲液中的浓度为2.496g/L；所述提取试剂在结合缓冲液中的体积浓度为20％；所述提取试剂为氯化钠和吐温‑20的混合水溶液。2.根据权利要求1所述的乳铁蛋白提取用结合缓冲液，其特征在于，所述氯化钠在提取试剂中的质量浓度为146.1g/L；所述吐温‑20在提取试剂中的体积浓度为25％。3.权利要求1或2所述乳铁蛋白提取用结合缓冲液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按照所述制备原料的浓度配比，将十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠和提取试剂混合溶解于水，得到乳铁蛋白提取用结合缓冲液；所述提取试剂为氯化钠和吐温‑20的混合水溶液。4.权利要求1或2所述乳铁蛋白提取用结合缓冲液或权利要求3所述制备方法制备得到的乳铁蛋白提取用结合缓冲液在检测乳铁蛋白中的应用。5.一种牛乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有牛乳铁蛋白的样品与结合缓冲液混合，进行提取，得到提取液；所述结合缓冲液为权利要求1或2所述乳铁蛋白提取用结合缓冲液或权利要求3所述制备方法制备得到的乳铁蛋白提取用结合缓冲液；采用肝素亲和柱，将所述提取液进行净化，得到含有纯化乳铁蛋白的净化液；将所述含有纯化乳铁蛋白的净化液进行高效液相色谱检测，得到乳铁蛋白含量。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述含有牛乳铁蛋白的样品与结合缓冲液的用量比为(1～20)g:50mL。7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述提取的次数为1～2次；每次提取的温度为4℃，时间为10min。8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的条件包括：梯度洗脱程序：0～5min，流动相A70％，流动相B30％；5.0～10min，流动相A45％，流动相B55％；10.00～12min，流动相A40％，流动相B60％；12.00～16min，流动相A70％，流动相B30％；所述流动相A为质量浓度0.1％的TFA；所述流动相B为乙腈。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的条件还包括：检测波长：紫外280nm；柱温：30℃；进样体积：30μL；流速：1mL/min。10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述乳铁蛋白含量＝(高效液相色谱检测的上机检测浓度×4(肝素亲和柱的洗脱体积)×肝素亲和柱的定容体积)/(肝素亲和柱的上样体积×称样量×1000)mg/g；所述上机检测浓度的单位为μg/mL；所述洗脱体积、定容体积和上样体积的单位均为mL；所述称样量的单位为g。2CN114414687A说明书1/12页一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液及其制备方法和应用、牛乳铁蛋白的检测方法技术领域[0001]本发明涉及蛋白质检测技术领域，尤其涉及一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液及其制备方法和应用、牛乳铁蛋白的检测方法。背景技术[0002]乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是乳汁中一种重要的铁结合糖蛋白，相对分子质量为70～80kDa，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌，广泛分布于哺乳动物乳汁中，特别是初乳中，在其他多种组织分泌液(唾液、泪液或胆汁等)中也含有乳铁