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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106635974A(43)申请公布日2017.05.10(21)申请号201610910131.2(22)申请日2016.10.19(71)申请人浙江译美生物科技有限公司地址310020浙江省杭州市江干区新塘路82号新业大厦10楼A区(72)发明人陈继冰吴振化(74)专利代理机构北京维正专利代理有限公司11508代理人林乐飞(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)权利要求书2页说明书8页(54)发明名称一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法(57)摘要本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法,该分离和培养方法包括以下步骤:新生儿新鲜的离体脐带→低温PBS液保存、冲洗→低温浸泡液中剪切→低温PBS液冲洗,低温真空处理→解冻→加入PBS液浸润→加入第一混合酶溶液,振荡酶解处理→加入第二混合酶溶液,振荡酶解处理→加入胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培养基,静置后离心,弃上清→加入PBS液,静置后离心,弃上清→加入胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培养基,静置后离心,弃上清→加入胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培养基,混匀→扩增培养;具有提高脐带间充质干细胞纯度的效果。CN106635974ACN106635974A权利要求书1/2页1.一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法,其特征在于,包括以下步骤:i.取新生儿新鲜的离体脐带,将其置于控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液中,保存待用;ii.取出经步骤i处理的脐带,用控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液多次冲洗,至无血迹残留;iii.在控温为2~5℃的浸泡液环境中,剪切洗涤后的脐带,剪切过程中剔除动静脉;所述脐带和浸泡液的用量比为1g:10~20ml,所述浸泡液包括0.9~1.0g/L的葡萄糖、10~20g/L的乙醇,余量为水;iv.取剪切后的脐带,用控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液冲洗2~3次,将其放入培养瓶后置于控温为-80~-70℃且控真空度为10~30Pa的环境下5~20min,除去脐带上的溶剂;v.取培养瓶密封处理,将其置于控温为-40~-35℃的环境中,待培养瓶的温度升至-40~-35℃时则将培养瓶转移至控温为-5~0℃的环境中,待培养瓶的温度升至-5~0℃时则将培养瓶转移至控温为37℃的环境中,至其内的脐带解冻完全;vi.取经步骤v处理的培养瓶,于其内加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液;其中所述脐带和PBS液的用量比为1g:0.5~1ml,振荡1~5min使脐带和PBS液充分接触;vii.取经步骤vi处理的培养瓶,于其内加入第一混合酶溶液,振荡处理,振荡用的水浴控温曲线为:0-5min,15℃恒温→5.01-20min,匀速升温至25℃→20.01-30min,25℃恒温→30.01-40min,匀速升温至37℃→40.01-75min,37℃恒温→75.01-90min,自然冷却至25℃;其中所述脐带和第一混合酶溶液的用量比为1g:2~5ml,所述第一混合酶溶液包括1~2mg/g的胰蛋白酶-EDTA消化液、2~3mg/g的胶原酶II、5~10mg/g的乙醇,余量为水;viii.取经步骤vii处理的培养瓶,于其内加入第二混合酶溶液,振荡处理,振荡用的水浴控温曲线为:0-2min,25℃恒温→2.01-10min,匀速升温至30℃→10.01-15min,30℃恒温→15.01-20min,匀速升温至37℃→20.01-60min,37℃恒温→60.01-75min,自然冷却至25℃;其中所述脐带和第二混合酶溶液的用量比为0.5g:2~5ml,所述第二混合酶溶液包括0.5~1mg/g的胶原酶II、0.5~1mg/g透明质酸酶、0.2~0.5mg/g的DNA水解酶、2~5mg/g的乙醇,余量为水;IX.取经步骤viii处理的培养瓶,加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和0.1g/L链霉素的LG-DMEM培养基,于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min;其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.2~0.5ml:1~2ml:2~5ml;X.取经步骤IX处理的培养瓶,加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液,于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min,弃上清;其中所述脐带和PBS液用量比为1g:2~5ml;XI.取经步骤X处理的培养瓶,加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PB