人脐带间充质干细胞的提取和培养方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102965338A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102965338A(43)申请公布日2013.03.13(21)申请号201210510379.1(22)申请日2012.12.04(71)申请人东南大学地址211189江苏省南京市江宁开发区东南大学路2号(72)发明人肖忠党孟宪会孙博胡飞虎梁高峰(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙)32204代理人柏尚春(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)权利要求书权利要求书1页1页说明书说明书44页页附图附图33页(54)发明名称人脐带间充质干细胞的提取和培养方法(57)摘要本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的提取和培养方法。脐带组织切碎后经I型胶原酶消化后移入含培养基的培养瓶中持续培养。所用培养基为低糖DMEM基础培养基并且添加了胎牛血清、成纤维生长因子、上皮细胞生长因子、细胞转录因子、胆固醇。使用本发明的提取和培养方法可以长期培养人的脐带间充质干细胞，并且维持干细胞活性。本发明解决了目前人脐带间充质干细胞培养中细胞衰老过快以及分化问题，能够长期获得具有干细胞特性的人脐带间充质干细胞。CN10296538ACN102965338A权利要求书1/1页1.一种人脐带间充质干细胞的提取和培养方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：步骤1：取健康胎儿脐带切去动脉和静脉，剪碎；步骤2：用I型胶原酶消化脐带；步骤3：磷酸盐缓冲液清洗组织块；步骤4：组织块移入培养瓶中，加入培养基；步骤5：培养瓶放入培养箱中持续传代培养。2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的提取和培养方法，其特征在于：步骤1中，脐带去除两天脐动脉和一条脐静脉，并剪碎至0.5mm3-2mm3。3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的提取和培养方法，其特征在于：步骤2中，脐带使用I型胶原酶消化，I型胶原酶的质量体积比为0.2%-1%，每克脐带组织使用0.5-2毫升I型胶原酶消化，消化时间为1-3小时。4.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的提取和培养方法，其特征在于：步骤4中使用的培养基成分包括胎牛血清，人成纤维生长因子，人上皮细胞生长因子，细胞转录因子，胆固醇。5.根据权利要求4所述的人脐带间充质干细胞的提取和培养方法，其特征在于：培养基的成分配比为胎牛血清5%-10%，人成纤维生长因子5-10ng/ml，人上皮细胞生长因子5-10ng/ml，细胞转录因子1-5ng/ml，胆固醇10-20ng/ml。6.根据权利要求1的人脐带间充质干细胞的提取和培养方法，其特征在于：培养基使用低糖DMEM培养基，并且加入了质量体积比0.5%-2%的青霉素和链霉素。2CN102965338A说明书1/4页人脐带间充质干细胞的提取和培养方法技术领域[0001]本发明涉及一种人脐带间充质干细胞的提取和培养方法。背景技术[0002]间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是一种来源于中胚层和外胚层的多潜能干细胞，属于成体干细胞。间充质干细胞具有自我更新的能力，并具有多向分化潜能，在特定诱导条件下能分化为骨骼、软骨、脂肪、神经、心肌等多种组织细胞。间充质干细胞存在于多种组织中，目前已经从骨髓、脂肪、肌肉等组织中成功获得了间充质干细胞。来源于成体组织中的间充质干细胞由于数量有限，且受患者年龄、疾病等因素的影响，限制了其在临床上的应用。脐带以及脐带血以其非侵入式的获得方式，对捐献者不会造成任何损害而成为一种理想的间充质干细胞来源。而与脐带血相比，脐带来源的间充质干细胞更易于获得和培养。每条脐带的间充质干细胞的数目为4×105个，密度为10-15×103个/cm，而每份脐带血中的数目为1-5×103骨髓中的数目为每106个单个核细胞含有1-10个间充质干细胞。[0003]脐带的结构从外到内依次为脐带上皮、羊膜下基质、裂隙、血管间基质（华通胶）、血管周围基质、血管（两动脉一静脉）。目前从脐带的不同组织部位都获得了间充质干细胞，而其主要来源是血管间的华通胶基质。脐带组织包含丰富的间充质干细胞，脐带间充质干细胞具有以下特点：（1）增殖能力强：体外培养第7代后可扩增300倍，且无明显衰老迹象。（2）免疫原性低：脐带间充质干细胞可剂量依赖性的抑制激活T淋巴细胞增殖，同时可维持和促进调节性T淋巴细胞扩增。脐带间充质干细胞抑制免疫细胞的增殖，不会引起同种异源或异种免疫细胞的增殖，具有免疫调节作用和较低的免疫原性。（3）致肿瘤风险低：脐带间充质干细胞具有稳定的端粒酶活性，培养多代也不会丧失锚定依赖性和血清依赖性，在维持其增殖性的同时不具有致肿瘤性。发明内容[0004]技术问题：本发明要解决的技术问题是提供一种能长期维持人脐带间充质干细胞活性的提取和培