一种脐带间充质干细胞的分离培养方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110577929A(43)申请公布日2019.12.17(21)申请号201910881502.2(22)申请日2019.09.18(71)申请人安徽科门生物科技有限公司地址230000安徽省合肥市高新区潜水东路7号3楼(72)发明人张鹏成(74)专利代理机构合肥市长远专利代理事务所(普通合伙)34119代理人刘勇(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)权利要求书1页说明书4页(54)发明名称一种脐带间充质干细胞的分离培养方法(57)摘要本发明公开了一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤:S1、采集脐带，剔除血管后清洗干净，获得脐带基质；S2、将脐带基质剪成小块，加入胶原蛋白酶液消化15-20min，然后终止消化；S3、离心，弃去上清液，向残留的组织块中加入组织块处理液，处理3-5min后再次离心，弃去上清液，获得待培养组织块；S4、将待培养组织块进行接种培养，待细胞达到80-90％融合度时去除组织块，消化、传代，得到脐带间充质干细胞。本发明既能缩短脐带间充质干细胞的提取时间，又能减少细胞的老化、损伤，使获得的细胞具有较高的增殖活性，有利于脐带间充质干细胞在体外的快速扩增。CN110577929ACN110577929A权利要求书1/1页1.一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、采集脐带，剔除血管后清洗干净，获得脐带基质；S2、将脐带基质剪成小块，加入胶原蛋白酶液消化15-20min，然后终止消化；S3、离心，弃去上清液，向残留的组织块中加入组织块处理液，处理3-5min后再次离心，弃去上清液，获得待培养组织块；所述组织块处理液包括下述原料：聚乙二醇，鼠李糖脂，泊洛沙姆188，PBS溶液；S4、将待培养组织块进行接种培养，待细胞达到80-90％融合度时去除组织块，消化、传代，得到脐带间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述组织块处理液包括下述质量百分比的原料：聚乙二醇0.01-0.02％，鼠李糖脂0.01-0.02％，泊洛沙姆1880.05-0.1％，余量为PBS溶液。3.根据权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述组织块处理液中，聚乙二醇、鼠李糖脂和泊洛沙姆188的质量比为1:1:4。4.根据权利要求1-3任一项所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述胶原蛋白酶液为I型胶原蛋白酶的D-Hank’平衡盐溶液；优选地，所述I型胶原蛋白酶的质量浓度为0.05-0.1％；优选地，所述胶原蛋白酶液与脐带基质的质量比为(1-2)：1。5.根据权利要求1-4任一项所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述组织块处理液与组织块的质量比为(1-2)：1。6.根据权利要求1-5任一项所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤S2中，脐带基质剪成小块的大小为5-10mm3。7.根据权利要求1-6任一项所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤S4中，接种培养的具体步骤为：将待培养组织块接种于培养瓶中，每瓶接种4-6块，加入培养液，在37℃、5％CO2条件下进行培养，2-3d后首次更换新鲜培养液，以后每2-3d更换新鲜培养液。8.根据权利要求1-7任一项所述的脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤S4中，消化采用0.125-0.25％的胰酶溶液。2CN110577929A说明书1/4页一种脐带间充质干细胞的分离培养方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞的分离培养方法。背景技术[0002]间充质干细胞是中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，可在体外扩增培养，并能在特定条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞等。其中，脐带间充质干细胞是存在于新生儿脐带组织中的间充质干细胞，由于取材方便而备受研究者的青睐。[0003]传统的脐带间充质干细胞分离方法是植块法，即将脐带组织块直接贴壁培养，培养时间长，分离效率低，获得的脐带间充质干细胞数量极低；目前，有研究将植块法与酶消化法联用，可以大大缩短脐带间充质干细胞的分离时间，但是长时间的酶消化处理容易导致细胞发生损伤、老化聚团，得到的细胞增殖活性不佳，无法在体外快速扩增，获得大量脐带间充质干细胞。发明内容[0004]基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，既能缩短脐带间充质干细胞的分离时间，又能使获得的细胞具有较高的增殖活性，能够体外快速扩增。[0005]本发明提出的脐带间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：[0006]S1、采集脐带，